五、CYP1B1基因与青光眼

    迄今为止人们通过典型家系的连锁分析，共找到三个与原发性先天性青光眼相关的基因位点（GLC3A 、GLC3B、GLC3C），其中已经确认CYP1B1是位于GLC3A位点上的致病基因，而在其他两个位点上仍未找到致病基因。最近，Ali等和Narooie-Nejad等报道LTBP2（Gene encoding latent transforming growth factor beta binding protein 2）的基因突变可导致原发性婴幼儿型青光眼（PCG），该基因与GLC3C位点仅间隔1.3 Mb。

    （一）CYP1B1基因的发现和定位

    细胞色素P4501Bl（Cytochrome P4501B1，CYP1B1）是CYP超家族中家族1亚家族B的惟一多肽，是一种亚铁血红素一硫醇盐单加氧酶，主要位于细胞的内质网、内质网膜和外周膜结构内。

    1995年，Sarfarazi等用连锁分析从17个土耳其家系中得到第一个先天性青光眼基因位点GLC3A，定位于2p21，D2S1788/D2S1325与D2S1356之间的染色体区域，其中11个家系符合该位点。随后Plásilová等又在7个吉普赛人PCG家系中证实了该位点。1997年Stoilov等基于当时的STSs和ESTs数据，联合应用STRs分子标记、YAC克隆筛选及放射性杂交等技术，首先确定SPTBN1、hSOS1、PRKR、CYP1B1、SFRS7为GLC3A的候选基因，然后通过直接测序、寻找与表型共分离的突变位点，最终确定CYP1B1为PCG的致病基因。

    （二）CYP1B1基因的结构和表达

    CYP1B1基因定位于2p21～22，全长8547 bp，由三个外显子和两个内含子组成（OMIM 601771）。其转录子长度为5.1 kb，编码区始于第二外显子，编码蛋白含543个氨基酸，是一种膜结合蛋白。CYPIB1蛋白C端半侧具有细胞色素P450家族的保守核心结构，包括四个螺旋束、螺旋J、K、两个β折叠片层、血红素结合域以及紧邻血红素结合域的曲折区域。这些保守结构元件认为是参与了和血红素结合的重要功能。CYP1B1蛋白的N端为含有疏水氨基酸残端的跨膜区域，紧邻该区域的是富含脯氨酸的铰链区域（hinge region），该结构域具有保持跨膜区和胞质区的曲折柔韧性的能力。

    CYP1B1可在全身多种组织中表达，如肾、心、脾、脑、肺、肝、骨骼肌、胸腺、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、乳腺、胎盘、小肠、大肠、淋巴结及外周血白细胞等，说明其在人类相关器官的分化、发育及功能行使中具有重要作用。

    人眼中CYP1B1 mRNA在虹膜和睫状体中的水平相对高于角膜、视网膜色素上皮和视网膜。免疫组化分析提示CYP1B1蛋白表达在人胎儿和成人眼中小梁网是缺失的，但是在睫状体非色素上皮细胞和视网膜中出现。不过也有证据表明，CYP1B1的转录产物在成年人的小梁网cDNA基因库中能测到。在鼠和人眼中都有CYP1B1的保守表达，在眼各个组织中的表达不同，胎儿眼中表达高于成人，在眼的功能和发育过程中起作用。睫状体上皮CYP1B1的改变会导致重要内源性底物代谢的降低和缺失，从而引起发育缺陷。在青光眼患者中，睫状体基因表达的突变可以直接导致眼内压的异常升高，或者中断正常的小梁网发育过程从而间接地影响房水的流出。通过睫状体衍生调节因子的代谢作用参与这些过程，从而影响IOP。CYP1B1可能是眼部发育相关的某种内源性底物的重要代谢酶，如花生四烯酸类物质经CYP1B1催化后的代谢产物通过抑制眼前节上皮细胞Na＋-K＋-ATP酶的活性，从而调节角膜透明性和房水分泌。其组织特异性与眼前节的形态发育及功能形成密切相关，从而可能参与PCG的发生发展。

    （三）CYP1B1基因的突变研究

    CYP1B1 自发现之日起，在各人种人群先天性青光眼的筛查中不断发现新的突变。与其他3个青光眼相关致病基因（MYOC、OPTN和WDR36）一样，CYP1B1的突变率在具有家族史的患者中明显高于散发病例。在家族性病例中，CYP1B1的突变率从100%（斯洛伐克吉普赛人）、92%（沙特**）到55.6%（巴西）。对于散发病例CYP1B1的突变率则从41.7%（巴西）、37.5%（印度）、34%（摩洛哥）、33.3%（印度尼西亚）、22.3%（欧洲）到20%（日本）。

    CYP1B1绝大多数的致病突变为纯合突变或复合杂合突变，偶尔也有报道单纯杂合突变发病者。据统计CYP1B1的突变共有82个（表2）。

    表2列出了从PCG、PA、RA和POAG患者中发现的82个变异。包括46个错义突变、10个无义突变、16个缺失、8个插入和（或）重复和2个同义突变。大约1/3的突变是基因插入或者缺失造成的，说明CYP1B1对于复合事件有较高的易感性。在POAG，PA和RA患者中CYP1B1突变比最初想象的具有更宽范围的临床表型。在PCG中，通过遗传连锁分析和突变扫描，CYP1B1最初被定位于GLC3A上。研究表示：CYP1B1是Peters′异常的一个致病因素，在这些患者中有4个位点的突变（Trp57stop、Met1Thr、Pro118Thr和Arg368His）和一个缺失（g.7889～7910缺失，R355～A358缺失）。另有证据表明，CYP1B1在病理生理学机制上和PCG以及其他的眼前节发育不良是相同的。

    研究发现，Rieger′s 异常中存在CYP1B1基因的突变（Trp57stop、g.4832～4834缺失、g.4838～4840缺失和g.8037～8046重复）。在PCG和POAG分离的特定家系中，这两种形式的青光眼可能具有相同或重叠的CYP1B1介导的病理生理学机制。有研究揭示，在同一个家系中PCG和POAG的变异共存。此外，CYP1B1和MYOC变异的二基因遗传导致的表型出现在更多报道中，提示CYP1B1可能是MYOC基因的修饰因子。但是，236个无关的法国高加索人POAG患者中的11个有CYP1B1的突变但MYOC基因没有突变。这些个体为青年或者中年发病，发病时间显著早于那些没有携带CYP1B1突变基因的患者。除了一个无义突变，所有的这些突变都可以在PCG病例中检测到。对印度人群的研究发现，200个POAG患者中的9个患者具有6个CYP1B1的突变。在这些突变中，其中1个是新发现的纯合突变（Arg523Thr），3个是以前在PCG患者中报道过的（Trp57Cys、Glu229Lys和Arg368His），2个是新发现的杂合突变（Ser515Leu和Asp530Gly）。

    在一个青少年发病的POAG家系中（缺少MYOC或OPTN突变）检测到了Arg523Thr，这个位点与疾病共分离，是一种常染色体隐性遗传方式。在这个研究中检测到了在CYP1B1区域中所有新发现的突变（Arg523Thr、Ser515Leu和Asp530Gly），没有包含PCG或其他眼前节发育不良中的错义突变。Chen等在一个中国发育型青光眼家系中发现，两个CYP1B1的SNPs （Arg48Gly和372-12 C>T）在所有的患者中都被检测到，可能与MYOC基因的杂合突变Pro370Leu一起，对该家系的发育型青光眼共同作用。这些研究都提示CYP1B1在PCG和其他眼前节发育不良中起的致病作用比最初想象的更为重要，修饰POAG的病理发生过程，或者在一些条件下直接就是导致JOAG的主要原因。

    近两年来，CYP1B1又有多个突变被发现与青光眼相关。Huang等在一例PCG患者上发现在CYP1B1基因的第二外显子上有c.C319G、L107V两个错义突变，在其他的PCG患者上发现4个SNPs，分别为R48G、A119S、V432L和D449D 。

    Paolera等对30例巴西的PCG患者进行CYP1B1的突变研究发现，其中9例（30%）有CYP1B1基因的突变，包括有已报道的突变Q19X、P437L、A443G、g.4340delG、 g.7901_79013delG- AGTGCAGGCAGA、g.8182delG、 g.8214_8215delG和三个新突变，分别是4635delT、4523delC和L378Q，以及3793T->C、R48G、A119S、L432V、D449D和N453S 多态性改变。

    Hilal等对90例摩洛哥的PCG患者以及100名正常对照组进行了CYP1B1和MYOC突变分析的研究。在43例PCG患者中发现有12种CYP1B1的突变，其中有3个新突变，分别是 p.R163C、p.C470Y和g.4330-4331delTG，伴随有中度或严重的表型。同时发现有2个新的基因内多态性。g.4339delG 突变频率最高，在31个家系中均有发现，其次是p.G61E。而其他突变，包括p.R163C、p.E173K、g.4330-4331delTG、p.E229K、p.R390S、p.R368H、p.R469W、p.C470Y和g.7901-7913del13bp则比较少。

    最初研究表明，CYP1B1基因的突变呈现完全外显，但Bejjani等[65]在沙特的病例筛选中发现CYP1B1基因的外显率大约仅为73%，因此推测可能另外存在非连锁于GLC3A的抑制基因。此后突变体功能的研究证实，并非所有的突变均导致蛋白功能的完全丧失，有些突变仍可产生具有部分功能的蛋白。

    CYP1B1的突变大多位于富含脯氨酸的铰链区和保守核心区，从而影响到分子的正确折叠、与血红素结合的能力、形成复合物的稳定性、对底物的作用等。Panicker等比较了45 位携带CYP1B1基因突变的先天性青光眼患者的基因型和表型的关系，发现在所有的突变中移码突变产生的表型最为严重，这可能是由于移码造成CYP1B1 基因C端重要结构域的全部丢失，产生无功能的蛋白所致。

    CYP1B1的晶体结构还没有被探明，但是可以根据许多P450的保守序列来推测。这些相似的模型提示CYP1B1错义突变会影响到P450酶高度保守和重要的功能区域。例如：与Trp57Cys、Gly61Glu、Gly365Trp、Pro379Leu、Arg390His、Glu387Lys、Pro437Leu和Arg469Trp有关的突变在铰链或保守编码蛋白区域会破裂。另一个研究提示Asp192Val、Ala330Phe、Val364Met和Arg444Gln的突变会导致CYP1B1蛋白有意义的结构改变。研究表明，野生型和突变型结构对应的8个PCG突变（Ala115Pro、Met132Arg、Gln144Pro、Pro193Leu、Glu229Lys、Ser239Arg、Arg368His和Gly466Asp）都可以发展为相应模型来进行研究。用这些模型来进行分子动力学模拟实验从而研究重要功能区的定时演变和结构性的时间平均值。研究表明，对那些表现为脑回钙化，牛眼，早发性青光眼的SWS患者需进行CYP1B1的突变分析。因血管畸形引起的静脉怒张以及增加的眼内压，均可能导致表型加重。这将有助于对病程的预后和治疗，也可帮助对这些病例的广泛咨询[67]。

    六、结语与展望

    近年来，对POAG遗传相关基因的研究很多，但仍存在很多问题：
    （1）目前只发现与之相关的3个基因，且这3个相关基因在此病产生的机制尚不清楚；
    （2）POAG遗传基因存在地区差异性，研究所得基因缺乏全面性及针对性，不能代表普遍现象；
    （3）OPTN是不是POAG的第二个致病基因还存在争议。MYOC和OPTN 基因之间可能产生相互作用，但具体原因也未明确；
    （4）基因打靶技术的应用需要有具体的致病基因，但致使POAG产生的基因多样且十分复杂，每个患者突变基因不同，因此很难应用于临床。相信随着分子生物学的发展，对青光眼相关致病基因研究将会更加深入和清晰。

    最近的结论已经证实CYP1B1是PCG的致病基因，且作为POAG的修饰基因，但很少被认为是POAG和其他一些眼前节发育不良的致病基因。CYP1B1缺陷鼠显示了眼房水循环系统结构的异常，相似于人类PCG的患者。CYP1B1在青光眼中的作用到底是什么？目前的假说是CYP1B1代谢了内源性的底物来产生发育中需要的代谢产物，或者清除发育中关键的底物。CYP1B1可能参与类固醇、花生四烯酸、维生素A以及N-乙酰-5-氧基色胺的代谢。所有这些代谢通路都可能产生信号分子来参与青光眼和其他眼前节发育不良的发展和病理生理过程。但是问题的关键是哪一个通路是致病性的及重要的，也不排除还有另外一个CYP1B1介导的通路参与青光眼的可能。在青光眼患者中观察到的CYP1B1等位基因异质性支持了这一假说，同时也说明很可能CYP1B1不同突变导致酶活性水平发生变化或者甚至改变了底物的特性。这可能影响了CYP1B1介导的代谢过程，在不同个体中CYP1B1代谢产物的浓度和产生不同的表型。

    目前关于PCG患者基因型（CYP1B1突变）-表型（房角发育不良的程度和疾病严重程度）的研究说明，特异性的CYP1B1的突变可能和房角异常严重程度有关，这些研究提供给青光眼专家分子学工具来诊断PCG。但是需要进一步研究青光眼和其他眼前节发育不良疾病中CYP1B1的确切作用。CYP1B1缺陷鼠提供了很好的实验模型，可以研究野生型鼠和CYP1B1基因缺陷鼠的房水代谢过程来阐明CYP1B1代谢了内源性的底物，从而在发育过程中产生或者消除对发育非常重要的底物。进一步利用蛋白组学方法对这些鼠类在不同发育阶段眼前节的基因表达，可以揭示CYP1B1在青光眼中起到的病理作用。（青光眼分子遗传学研究进展 蔡素萍，陈晓明，闫乃红，刘旭阳）