胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，发病率在世界范围内的恶性肿瘤中占第二位，其发病机制目前并不十分清楚。大多数学者认为，胃癌的发生是物理、化学、生物等多因素、多阶段的发展过程。1990年Burke等首次报道了1例EBV阳性胃癌，自此EBV感染与胃癌的关系受到关注。EBV最初是由Epstein和Barr从非洲伯基特淋巴瘤（BL）培养中发现的，它与多种人类肿瘤有关。目前，对EBV相关胃癌的研究主要在临床病理方面，而EBV感染后胃上皮细胞变化的分子机制尚不明确。笔者采用EBV感染和PAR-2基因转染体外培养的胃上皮细胞系GES-1,对比分析细胞生物学特性的变化，从而探讨PAR-2基因在EBV致胃癌发生发展中的作用。

    1.材料与方法

    1.1主要试剂

    脂质体Lipofect AMINETM 2000 regent,G418购自Invitrogen公司；小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶、XDNA/Hind m maker，200 by DNA stepladder、琼脂糖购自华美生物技术工程公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清（FCS）购自基因公司；免疫细胞化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胃癌病人血清为来自本院肿瘤科；载体和细胞株：pcDNA3空载体质粒、pcDNA3-c-myC重组质粒及携带NEW基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061均为广州安必平生物科技有限公司提供；人胃上皮细胞系GFS-1由南方医科大学肿瘤研究所提供；大肠杆菌HB 101由安必平生物科技有限公司提供。

    1.2 细胞的培养

    人胃上皮细胞系GES-1用含10%FCS,100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞2~3天换1次液，细胞融合约达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代。Akata细胞为悬浮生长的淋巴细胞，具有G418抗性。常规悬浮细胞培养方法，另含700mg/L G418。

    1.3 pcDNA3-PAR-2重组质粒及pcDNA3空载体质粒的获得

    取感受态的大肠杆菌，按质粒小量提取方法进行质粒DNA的提取和纯化，用BamHI酶切后电泳鉴定，用Quantity one图像分析软件进行灰度测定，计算提取质粒的浓度，并根据此浓度确定转染所需的量。

    1.4 基因转染及阳性克隆筛选

    将pcDNA3-c-myc重组质粒及pcDNA3空载体质粒按1：2~1：3的量用脂质体法分别转染24孔板中90%~93%融合的GES-1细胞，按试剂盒操作手册进行。37℃转染5h后，加人FCS至终浓度10%。48h后用有限稀释法进行阳性克隆，并置于含300mg/L G418（根据预实验结果而定）的选择培养基中，筛选培养2周，待抗性单克隆长至足够大，挑取单克隆集落，扩大培养，制备细胞片。EBV感染及阳性克隆筛选：感染前3天，Akata1061细胞稀释至2×103/ml，加入终浓度为0.5%山羊抗人降解血清，于37℃培养2h，不时轻轻摇动，然后以PBS洗2次，以含10 % FCS的RPMI 1640培养基继续培养。感染前1天，将GES-1细胞以2mmol/LEIYI'A/PBS消化下来，置于12孔培养板中，每孔2ml培养基，含5×103细胞。转染当天更换等体积培养基。转染时每孔加人1ml Akata细胞悬液，于37℃，5%CO2培养箱中共同培养3天。在第2天更新一半培养基，使FCS浓度降至5%。此过程结束后，以PBS洗4次，加人2 ml含10% FCS的培养基。感染后第5天，将细胞消化下来，稀释至2×102/ml，接种于96孔板中培养至克隆形成。此过程中，培养基中加入终浓度为300mmol/L的G418和终浓度为1mmol/L的更昔洛韦（仅第1周）。将所获得的细胞克隆常规培养并制备细胞片。

    1.5 EBNAl及PAR-2蛋白的检测

    将EBV感染细胞片用FTIC标记的免疫细胞化学方法检测EBNAI的表达；感染和转染细胞片检测PAR-2蛋白的表达。免疫细胞化学检测方法按说明书操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞内出现明确亮绿色判定为阳性结果。

    1.6 细胞生长曲线测定

    取EBV感染、c-myc基因转染及对照细胞培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，经计数后以3×103个/孔接种于24孔板，每孔加人无血清培养基2ml培养1天使细胞同步化，换入含10% FCS的RPMI 1640培养基2ml继续培养。每天取4孔进行细胞计数，每孔重复计数3次，取其平均值，连续计数7天，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

    1.7 软琼脂克隆形成试验

    在6孔细胞培养板中，每孔先加入0.66%底层琼脂3ml（1.5ml 1.3%琼脂冷却至55℃左右，与1.5ml预温的37℃含2×RPMI1640培养基混匀），待凝固后，加入0.33%的含细胞的上层琼脂3ml，每组细胞均做复孔。置湿盒，在37℃，5% CO2及饱和湿度环境下培养2~3周，观察软琼脂中细胞集落的形成。

    1.8 细胞周期的测定

    分别收集各组细胞，经0.25%胰酶消化，离心收集细胞，冷PBS洗涤2次。加入预冷的70%酒精，4℃固定过夜。800~1000×g离心弃上清，冷PBS离心洗涤2次并重悬，制成单细胞悬液，注意离心速度不宜过快。等体积细胞悬液和碘化丙啶（ PI）染液混合，4℃放置20min×300目尼龙过滤，加样入流式细胞分析仪样品室，进行细胞周期检测。

    1.9 统计学处理

    采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析。设定P<0.05为差异有显著性。

    2.结果

    2.1 PWNA3-PAR-2重组质粒的鉴定

    扩增纯化的pcDNA3- PAR-2重组质粒经BamHⅠ酶切、电泳，可见PAR-2基因大小为1.3kb，pcDNA3载体为5.4kb，恰好在pcDNA3的BamHⅠ位点，与所提供的质粒图谱相符（图1）和PAR-2蛋白表达，转染了PAR-2基因的GES-1细胞有PAR-2蛋白表达，细胞均被染成亮绿色，阳性结果主要出现在细胞核，部分在细胞质，而空载体转染组及正常GES-1细胞均为阴性（图2、图3）。

    2.2 细胞形态学变化

    正常的GES-1细胞呈短梭形，大小较为一致，核较小呈圆形或椭圆形；感染及转染组细胞体积变大，呈椭圆形或多角形，核变大，核浆比增大，折光性增强，与正常GES-1细胞相比较，细胞增殖迅速，细胞生长的接触性抑制不明显，出现“成瘤性”生长（图4）。

    2.3 免疫组织化学染色结果

    FlTC标记免疫细胞化学染色显示，感染了EBV的GES-1细胞有EBNA1。

    2.4 细胞生长曲线测定

    细胞生长曲线如图3，可见EBV感染细胞及c-myc基因转染细胞数量均显著高于空载体转染细胞，并随培养时间增加，这一差异越来越明显；空载体转染细胞数与正常GES-1细胞相比差异无显著性（图3）。

    2.5 细胞周期测定

    经流式细胞仪进行细胞周期分析发现，EBV感染和c-myc基因转染细胞S期细胞比例[（70.%±0. 91%）和（67%±3 .06%）]显著高于pcDNA3转染对照细胞（34.74%±1.03%），差异有显著性（P<0.05）。而EBV感染与PAR-2基因转染细胞之间，以及pcDNA3转染细胞与正常GES-1细胞（49.35 %±1.16%）之间差异无显著性。

    3.讨论

    EBV是人类疱疹病毒N型，属DNA肿瘤病毒，EBV在人群中广泛存在，多数人幼儿期就感染EBV,且终生携带。EBV与BL、鼻咽癌（NPC）的关系最为明确，近年来EBV在上皮源性肿瘤发生、发展中的作用备受关注。1990年等Burke首次报道了1例EBV阳性胃癌以来，EBV感染与胃癌的关系受到关注。c-myc原癌基因在多种人类肿瘤细胞中均有扩增和高表达。有研究表明，在EBV相关的多种肿瘤如BL、NPC中都存在。my基因高表达，而PAR-2基因过度表达可以改变细胞内基因调控，引起其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使细胞易于转化为恶性表型，从而启动或加速肿瘤发生。在对人鼻咽上皮细胞的研究中发现，c- my基因表达增高能激活端粒酶活性，从而诱发肿瘤。有报道EBV阳性胃癌表达EBNA 1、BARFO、BARE 1和EBERs，将BARE 1基因导入非致瘤性louckes淋巴细胞中可活化PAR-2原癌基因。

    另外，临床病理学研究发现患有PAR-2产物阳性浸润性胃癌的病人预后明显差于PAR-2产物阴性肿瘤的病人。因此推测PAR-2基因在EBV相关胃癌的形成过程中起到一定的作用。实验中用的GES-1细胞为SV40感染原代培养的胎儿正常胃黏膜上皮细胞建立的细胞系，染色体为近三倍体（50~60之间）。除了转化特性之外，GES-1细胞基本保留了正常的细胞骨架结构，角蛋白反应阳性，接种在裸鼠中6个月观察无致瘤性，此细胞系为研究胃上皮细胞癌变提供重要的模式系统。Akata细胞来源于EBV阳性BL病人，通过同源重组插入一个新霉素抗性基因（Neo），因此具有G418抗性。经抗免疫球蛋白处理后，能产生大量重组EBV（每个细胞含EBV质粒20个拷贝）。Akata细胞适合重组EBV克隆繁殖，是探测EBV遗传学的有效工具，使EBV作为基因治疗的载体成为可能。

    本实验中，感染上皮细胞前，Akata细胞以0.5%山羊抗人降解血清预处理，目的即是产生大量重组EBV。由于Akata细胞中含另一个药物敏感基因（大T基因），因此培养基中加人1pmol的更昔洛韦后，Akata细胞被除去。用Imai等创立的密切接触法使人胃上皮细胞系GES-1感染重组EBV，用碱裂解法获得质粒，经过酶切鉴定后采用脂质体介导法将PAR-2基因转入GES-1细胞，以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照，由于pcDNA3携带GADPH基因，因此也具有G418抗性。经过G418筛选得到EBV感染和PAR-2基因转染的阳性克隆。对感染和转染细胞进行鉴定，用荧光（ME）和辣根过氧化物酶（HIiP）两种标记方法，细胞均被染成亮绿色或棕褐色，说明感染和转染获得成功，细胞均为阳性克隆。

    本实验中，用细胞计数和Mil两种方法测定细胞生长曲线，结果均显示从第3天开始EBV感染组与c-myc基因转染组细胞生长速度与对照组相比明显加快，并且随着培养时间的延长，这一差距越来越明显，到第7天EBV感染组细胞达到3.85×105个，几乎为对照组细胞数量的2倍，PAR-2基因转染组细胞数为3.14×105个，与感染组相比差异无显著性。细胞周期测定显示感染与转染组细胞S期细胞数目增多，两组之间差异无显著性，说明处于增殖期的细胞较多，此结果与细胞生长曲线结果相一致。经过荧光染色发现EBV感染细胞中有c-myc基因表达，提示EBV感染上皮细胞后可能通过某种方式上调PAR-2基因，引起其他癌基因变化，进一步影响细胞周期，使细胞增殖加快，从而使细胞发生永生化。实验中EBV感染的GES-1细胞发生明显形态学改变，由原来的短梭形变得更为饱满，细胞及细胞核体积明显增大，核浆比增大，细胞增殖迅速，细胞生长的接触性抑制不明显，说明EBV感染的细胞已经具有肿瘤细胞的某些特性。正常细胞生长依赖锚泊，有密度依赖抑制或接触抑制，肿瘤细胞则缺乏这种生长限制，甚至可在半固体琼脂中成悬浮生长，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持续分裂堆积生长。软琼脂集落形成试验是测定细胞成瘤性的一种有效方法。单细胞在体外持续增殖6代以上所组成的细胞群体，称为集落或克隆，可含有50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm之间。通过计数集落形成率，可对细胞的增殖潜力做定量分析。

    本实验中软琼脂中未见有细胞集落形成，提示EBV感染虽然可使胃上皮细胞增殖加快，但尚未转化为肿瘤细胞，即胃上皮细胞尚未发生癌变。究其原因，可能是因为实验中EBV感染上皮细胞的时间相对较短，而EBV相关胃癌的发生可能与EBV的长期潜伏有关。另外，肿瘤发生过程中癌基因与抑癌基因的相互作用也是一个漫长的发展过程。这种增殖加快的上皮细胞是否属于癌前病变的细胞，有待进一步研究。

    综上所述，EBV相关胃癌的发生及发展过程是十分复杂的。EBV感染胃上皮细胞后，表达诸如BARF1之类的病毒基因，通过这些基因产物激活c-myc、PAR-2基因等癌基因及一系列抑癌基因，进而影响细胞周期，细胞增殖加快，再在某些因素的影响下转变为肿瘤细胞。因此，PAR-2基因基因可能是EBV阳性胃癌发生发展过程中的关键介导基因。（Chinese Journal of Current Clinical Medicine刘换新，陈娟，刘梅，叶春）