一、简介：

    SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1-5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。

    优点：
    （1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；
    （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；
    （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。

    缺点：
    开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。

    二、操作程序：

    取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。

    1、DNA提取

    按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下：
    ① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存；
    ② 加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟；
    ③ 取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇；
    ④ 12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；
    ⑤ 加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液；
    ⑥ 干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE。

    2、PCR扩增

    模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下：
    Sterile ddH2O        11μl
    PCR Buffer              3μl
    dNTP-mix                 0.5μl
    Primer1                     1μl
    Primer2                     1μl
    Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）
    DNA                            3μl 
    PCR扩增程序为：（2h30min）

    ① 预变性：94℃，5分钟；
    ② 变  性：94℃，40秒；
    ③ 退  火：55℃  40秒；
    ④ 延  伸：72℃，1分钟；
    ⑤ 循  环：从2到4共38个循环；
    ⑥ 72℃下最后延伸5分钟；4℃ 5min，扩增产物置于4℃的冰箱保存。

    3、扩增产物的电泳分离

    制胶→灌胶→上样→电泳。

    扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下：
    ① 准备电极液（1×TBE）；
    ② 将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；
    ③ 不预电泳。
    ④ 点样，电泳220V；
    ⑤ 拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。

    4、凝胶染色

    ① 固定：10%醋酸，5分钟；
    ② 染色：10分钟；
    ③ 漂洗：dH2O，5-10秒；
    ④ 显色：甲醛-NaOH，直到满意为止；
    ⑤ 漂洗：dH2O，2分钟。

    5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。