肾间质纤维化是慢性肾脏病（CHRoNIC KIdNEydISEASE，CKD）不断进展的共同病理改变，其程度和患者预后密切相关，但目前尚无有效的治疗手段。

    由于CKD 起病隐袭，无论是在发达还是在发展中国家，很多患者在初次就诊时就已经步入CKD3 期或更严重的阶段，此时多已存在相当程度的肾间质纤维化，丧失了应用糖皮质激素或免疫抑制剂等针对病因治疗的时机，通常只能采取低蛋白饮食、血管紧张素Ⅱ活性抑制剂、降低血压等一般性保守治疗，而没有更有效的针对性强的治疗手段，多于数年后进展到终末期肾衰竭，而不得不加入肾脏替代治疗的行列，给个人和社会均带来沉重的经济负担。

    因此进一步解析肾间质纤维化机制，寻求新的有效干预途径，对降低终末期肾衰竭的发病率、减少巨额医疗开支，具有重要意义。

    随着人类基因组测序工作的完成，研究人员逐渐从基因组学研究转向研究生命的体现者蛋白质的表达模式和功能模式，但蛋白质在生命体内又是动态变化的，并存在多种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化等修饰，其中糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，对生命体起着至关重要的作用，人体内50％以上的蛋白质存在糖基化现象，糖基化对蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，蛋白质的糖基化，特别是N连接糖基化普遍发生在细胞外环境的蛋白质中，涉及到细胞免疫、蛋白翻译调控、蛋白降解等许多疾病的病理过程。

    在肾病的炎症、免疫紊乱的过程中均有糖类物质结构和功能的改变，由于聚糖代谢酶类活力的改变或缺陷，可导致糖复合物中的糖链数量和结构产生异常，最终导致肾脏细胞功能失常；

    糖链结构异常还可能被机体免疫系统识别，引起细胞免疫和体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，介导细胞毒性反应，引起肾脏细胞的损伤，所以糖复合物中糖链数量和结构变化与肾病关系密切。本文试图从糖生物学角度探讨肾间质纤维化的机制。

    一、信号通路在肾间质纤维化作用概述

    肾脏的系膜细胞和成纤维细胞活化、小管上皮间充质转分化（EMT）、单核/巨噬细胞、T 细胞浸润及细胞凋亡等细胞学事件促进了肾纤维化的进展。

    在这些过程中有多种细胞因子、生物活性物质的参与共同激活了多种信号通路，如：转化生长因子β1 （TGFβ1）/SMAd2 /3 通路、血小板源性生长因子（PDGF）/细胞外信号调节激酶（ERK）通路、无翅型蛋白（WNT）/β连环蛋白（βCATENIN）通路、锯齿状配体（JAGGEd，JAG）/翅缺痕蛋白（NoTCH）通路及大鼠肉瘤基因（RAS）通路等，多种信号通路的激活是肾间质纤维化的核心，其中TGFβ1 激活的TGFβ/果蝇母代抗同源序列蛋白（SMAd）2 /3 通路是最为强力的致肾间质纤维化信号通路，是近20 年来研究最为深入的致纤维化通路，其经典的激活过程是TGFβ1 首先与其Ⅱ型受体中的TGFβRII 结合，磷酸化TGFβRII，形成具有活性的“（TGFβRII）（TGFβ1）”复合物，使Ⅰ型受体TGFβ RI 中的激活素受体样激酶（ALK）4、ALK5、ALK7 磷酸化，形成“（TGFβRII）（TGFβ1 ）（TGFβRI）”三元复合物，激活下游的功能蛋白SMAd2 /3 或SMAd7，磷酸化的SMAdS 进入细胞核，启动纤维化过程。

    理论上推测，阻断或降低上述TGFβ的“致纤维化”信号传导通路活性可能成为有临床前景的治疗肾间质纤维化的途径。

    事实上，从10 余年前已经有学者开始这方面的努力：研究表明，抗TGFβ单克隆抗体、反义TGFβ1 寡核苷酸、天然的TGFβ抑制剂均能下调TGFβ表达，成功地减轻了实验动物肾脏纤维化，但由于上述方法同时也非选择性地抑制了TGFβ其它功能，可以导致发育异常、生长、免疫功能异常等难以克服的副作用，至今未能向临床应用拓展。

    近来，学者们将目光转向对TGFβ/SMAd2 /3 下游通路的调节上，受体蛋白TGFβRII 是其激活的关键下游环节，没有该受体蛋白的活化，该通路就无法激活，对它的调节有望在抑制通路激活的同时，避免阻断TGFβ1 所带来的副作用。

    已经有研究尝试通过下调或沉默TGFβRII 基因表达、抑制TGFβI 型受体中ALK5 的磷酸化来下调TGFβ“致纤维化”通路的活性，有效地抑制了动物模型的纤维化。

    上述研究的结果说明了通过受体水平干预该通路活性对纤维化抑制的可行性和有效性，但目前仍在实验室研究阶段。

    二、肾间质纤维化的糖生物学研究进展

    近年来的功能性糖蛋白组学在重大疾病的诊断标志物和新药靶目标方面研究的巨大进展和广阔的应用前景，为我们提供了一个新的研究途径。

    由于TGFβ“致纤维化”通路中两个关键起始受体TGFβRII 和ALK5 是糖蛋白，大连医科大学肾脏病研究所课题组推测糖基化修饰对它们致纤维化功能可能有关键作用。

    WANG 等利用α1，6 岩藻糖基转移酶（α1，6FUCoSylTRANSFERASE，FUT8）基因敲除小鼠直接有力地支持了这一推测：该研究结果表明TGFβRII 是由FUT8 催化的核心岩藻糖基化修饰的，沉默FUT8 使得TGFβRII 糖基化修饰不能进行，导致“TGFβ1 /TGFβRⅡ/SMAd2 /3”通路不能活化，发生肺气肿样改变。

    受这项研究工作的启示，大连医科大学肾脏病研究所课题组首次探讨了肾间质纤维化过程中，核心岩糖基化修饰通过修饰TGFβRII 对肾间质纤维化过程的影响，以此来探索糖生物学在肾间质纤维化中作用。

    （一）糖基化修饰在肾间质纤维化中作用的体外实验研究

    在体外实验中，大连医科大学肾脏病研究所课题组选用了人肾小管上皮细胞株2 （HUMAN KIdNEy2，HK2）细胞进行研究，首先用免疫荧光的方法确定HK2 细胞的胞浆和细胞表面均有中等量核心岩藻糖链的表达。

    然后，用5 NG/Ml TGFβ1 刺***K2 细胞48 H，结果发现TGFβ1 **后，HK2 细胞的核心岩藻糖基化水平明显升高，这提示核心岩藻糖基化修饰可能在促进TGFβ1 诱导的TGFβ/SMAd2/3 通路激活中发挥作用。

    TGFβRII 与ALK5 是TGFβ/SMAd2/3 信号转导通路的关键受体蛋白，为确定TGFβRII 与ALK5 与核心岩藻糖基化的关系，他们用异硫氰酸荧光素（FITC）小扁豆凝集素（LCA）与TGFβRII 或ALK5 进行免疫荧光测定蛋白与核心岩藻糖链的空间表达表位关系，结果显示肾小管上皮细胞中TGFβRII，ALK5 与核心岩藻糖链的表达表位完全重合，提示TGFβRII 及ALK5 受体蛋白均受到核心岩藻糖基化的修饰。

    接着，他们通过基因沉默的方法沉默了FUT8 基因后，检测TGFβ/SMAd2 /3 通路上TGFβRII 和ALK5 的变化。

    结果发现FUT8SIRNA 明显降低TGFβRII 和ALK5 的核心岩藻糖基化水平；如前所述，受体TGFβRII 和ALK5 正常发挥功能是TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的必要条件，那么，它们核心岩藻糖基化的缺失对其维持TGFβ/SMAd2 /3 通路激活的功能有什么影响呢？

    他们测定了TGFβ/SMAd2 /3 通路的活性，发现FUT8SIRNA 抑制了TGFβ1 诱导的PSMAd2 /3 的表达升高及其核转位，这表明在肾小管上皮细胞中，FUT8SIRNA 通过抑制TGFβRII 和ALK5 的核心岩藻糖基化修饰而抑制TGFβ/SMAd2 /3 通路的激活，提示核心岩藻糖基化修饰是TGFβRII 和ALK5 发挥功能必需的。

    接下来，他们采用5 NG/Ml 的TGFβl 无血清刺***K2 细胞48 小时后，相差显微镜下观察HK2 细胞形态的变化，发现HK2 细胞失去了原来的鹅卵石样形态，细胞呈现长梭形，细胞间隙扩大，排列紊乱，其上皮细胞表型特异性标志物ECAdHERIN 的表达出现了明显的下调，而肌成纤维细胞特异性表型α平滑肌肌动蛋白（SMooTH MUSClEACTIN，SMA），N钙粘素（CAdHERIN），成纤维细胞特异蛋白1 （FIbRoblAST SPECIFIC PRoTEIN1，FSP1）的表达则明显上调，提示TGFβl 成功诱导体外培养的HK2 细胞出现EMT。

    提前孵育FUT8SIRNA 能有效抑制E钙粘素的表达降低，同时阻止αSMA，N钙粘素以及FSP1 的表达升高。他们还发现，TGFβ1**细胞能明显导致细胞凋亡，而提前孵育FUT8SIRNA 24 H能有效的阻止TGFβ1 诱导的细胞凋亡。

    该课题组的研究第一次展示了核心岩藻糖基化修饰对TGFβ1 诱导的肾小管上皮细胞损伤中TGFβ/SMAd2 /3 信号通路活化的影响，并进一步抑制肾小管上皮细胞的EMT。

    研究成果发表在美国生理学杂志上。为了进一步验证以上发现，该课题组建立了单侧输尿管梗阻（UUO）肾间质纤维化大鼠体外实验模型，利用腺病毒FUT8SHRNA 有效的抑制大鼠肾间质组织中核心岩藻糖链的表达，观察肾小管间质中TGFβR 受体核心岩藻糖链的变化与肾间质纤维化的关系。

    结果发现，随着模型大鼠肾间质纤维化的加重，肾小管间质中的核心岩藻糖链表达水平逐渐上调，而注射腺病毒SHRNA 抑制大鼠FUT8 表达，能抑制TGFβRI 及TFGβRII 的核心岩藻糖基化修饰，进而抑制UUO 大鼠模型中的TGFβ/SMAd2 /3 信号通路的激活，作为这种分子干预的结果，UUO 模型中肾间质纤维化被显著抑制。

    值得注意的是，体内外实验均发现，在干预糖基化修饰过程中，TGFβR 表达水平并没有受到影响。研究结果首次证实了肾间质纤维化过程中TGFβR 的核心岩藻糖基化修饰发挥了关键性的作用，并发现其作用不依赖于所修饰蛋白本身的表达。

    研究结果发表在国际肾脏病杂志，美国德克萨斯州大学病理系教授ManjeriA及美国密西根大学医学部教授Joel M为该研究撰写了专栏述评，述评指出作者检测到在肾脏损伤模型中，利用糖生物学方法能够及时、有效、显著的抑制TGFβ通路并阻断肾间质纤维化进程，这一发现非常新颖，为肾脏中TGFβ通路调节的研究添加了新的启示，这是首次以崭新的视角检测TGFβ受体功能并为未来的研究打下了基础。

    （二）蛋白尿致肾间质纤维化的糖生物学机制

    上述研究只是从单一信号通路角度探讨肾间质纤维化的糖生物学机制，而临床上往往是多因素共同作用促进肾间质纤维化，蛋白尿就是一种能激活多个促纤维化通路的病理过程。

    研究证实，蛋白尿可作为一个***的病理因素直接导致肾间质纤维化的发生，它已经成为预测慢性肾脏病的不良预后最强烈的危险因素，但其导致肾间质纤维化的具体机制并不十分清楚。

    大连医科大学肾脏病研究所课题组试图在以往基础上进一步探讨糖基化修饰在蛋白尿导致肾间质纤维化过程中的作用。

    肾小管上皮细胞能通过位于肾小管刷状缘上的MEGAlIN 受体联合CUbIlIN 过度内吞尿蛋白，导致肾小管上皮细胞氧化应激、炎症损伤，进而促进肾间质纤维化发生，MoToyoSHI 等报道，当小鼠肾小管上皮细胞的MEGAlIN 基因被敲除后，肾小管无法吸收白蛋白，炎症反应减弱，小鼠肾间质纤维化减轻；

    而表达MEGAlIN 的肾小管上皮细胞的单核/巨噬细胞趋化蛋白（MoNoCyTE /MACRoPHAGE CHEMoTACTIC PRoTEIN1，MCP1）增加，炎症损伤加重，小鼠肾间质纤维化明显。因此，MEGAlIN 被认为是尿蛋白超负荷导致炎症反应的决定性因素。

    结构研究表明，MEGAlIN 属于糖蛋白，它受到核心岩藻糖基化的修饰。因此，推测核心岩藻糖基化修饰能够影响MEGAlIN 吸收蛋白的功能。

    为观察FUT8 基因转染后肾小管上皮细胞中MEGAlIN 绑定和内吞白蛋白的变化，课题组首先用免疫荧光双染测定MEGAlIN 是否受到核心岩藻糖基化的修饰，结果显示MEGAlIN 与核心岩藻糖链的表达表位完全重合，这提示，MEGAlIN 蛋白的确受到核心岩藻糖基化的修饰。

    推测MEGAlIN 与白蛋白结合能力很可能受其核心岩藻糖基化修饰的影响，为证实这一设想，他们进一步利用共聚焦显微镜及流式细胞术分析白蛋白的结合和内吞，二者结果显示抑制MEGAlIN 的核心岩藻糖基化能减少肾小管上皮细胞对白蛋白的结合和内吞，反之则能增加肾小管上皮细胞对白蛋白的结合和内吞，这提示MEGAlIN 的核心岩藻糖基化修饰是其结合和内吞白蛋白所必需的。

    为观察MEGAlIN 核心岩藻糖基化在白蛋白超负荷炎症损伤过程中的作用，他们首先用瞬时转染的方法将FUT8SIRNA 片段以及高表达FUT8 基因载体质粒转染细胞成功干扰了FUT8 目的基因。

    进一步检测了FUT8 基因沉默及过表达后炎症趋化因子MCP1 和受激活调节正常T 细胞表达和分泌因子（RANTES）的表达变化，结果发现，FUT8 基因的高表达能明显上调MCP1、RNATES 表达水平，而沉默FUT8 基因能明显下调MCP1、RANTES 表达。

    有研究表明，炎症趋化因子MCP1 及RANTES 的释放是白蛋白内吞依赖性的，而沉默了MEGAlIN 的核心岩藻糖基化能减少白蛋白的内吞，所以，沉默了MEGAlIN 的核心岩藻糖基化，能减少细胞对白蛋白的内吞而使炎症趋化因子MCP1，RANTES 的表达下降，从而抑制了肾小管上皮细胞的炎症损伤反应。

    这提示MEGAlIN 的核心岩藻糖基化修饰参与了白蛋白导致的肾小管上皮细胞的炎症损伤过程，阻断MEGlAIN 的核心岩藻糖基化修饰就能阻断白蛋白导致的肾小管上皮细胞的炎症损伤。

    本实验中，首次发现核心岩藻糖基化修饰是MEGAlIN发挥结合和内吞功能所必需的，揭示了肾小管结合和吸收蛋白过程中核心岩藻糖基化修饰的调控机制。

    此外，还发现抑制MEGAlIN 的核心岩藻糖基化能阻断白蛋白过度吸收导致的肾小管上皮细胞炎症损伤，这为临床上抗蛋白尿损伤提供了新的思路，同时揭示了蛋白尿与糖基化修饰二者之间的联系。以上研究，从糖生物学角度初步探讨了肾间质纤维化的糖生物学机制，为我们更深入的了解肾间质纤维化，寻找抗慢性肾脏病进展的策略，提供了新的视角。