作者：张丹凤  潘崚

    作者单位：四川大学华西医院血液科

    急性髓系白血病（AML）是一组基因改变导致的造血干细胞克隆性增殖失调的异质性疾病。尽管根据细胞遗传学、分子遗传学和临床表现等特征进行分层治疗可以提高年轻AML患者的治疗效果，但是老年AML患者的总体生存率仍然较差。最近几年，新一代测序技术已经证实在大部分AML患者中编码参与转录表观调节蛋白的基因频发突变，这促使人们对AML患者的表观基因组有了新的认识，并使针对表观突变基因的靶向治疗成为可能。现就2014年第56届美国血液学会（ASH）年会关于AML常见的表观遗传学基因突变及其重要作用、表观突变基因潜在的治疗靶点和去甲基化药物的临床应用等内容进行综述。

    1、AML和相关表观遗传学异常概述

    AML以分化受损、克隆性增殖、原始粒细胞聚积和临床症状急进性加重为特征，是成年人中最常见的急性白血病。2014年美国新发病例为19000例，中位发病年龄为67岁。AML的预后与患者年龄、细胞遗传学和分子遗传学异常以及一系列临床因素相关。最近几年，对预后有显著影响的基因突变重新界定了危险度分层，但是治疗选择性有限，总体预后仍然较差，大于60岁的AML患者平均5年生存率小于10%.

    目前，治疗AML最有效的方法是异基因造血干细胞移植，但是，即使运用减低剂量的预处理方案和显著优化的辅助支持技术，异基因造血干细胞移植仍然只能被用于小部分初次缓解或者二次缓解的患者，以及更少一部分初次难以缓解的患者。尽管进行了多种新药的临床试验，但并没有突破蒽环类药物联合阿糖胞苷的经典“3+7”方案的有效性。减低剂量的诱导化疗方案为不能耐受标准化疗方案的患者提供了可选择的治疗手段，但也大大降低了完全缓解（CR）率，对复发性AML更缺乏有效的治疗措施。

    近年检测技术的**性进步使人们对AML的发病机制有了全新的认识。体细胞基因突变的全基因组和外显子测序技术已经证实，在大于70%的AML患者中编码参与表观遗传学调控蛋白质的基因频发突变。表观遗传学调控包括DNA胞嘧啶残基的修饰和翻译后组蛋白乙酰化改变，其对基因的选择性表达和正常细胞向恶性肿瘤的转化起决定性作用。

    最重要的是，表观遗传学修饰是可遗传、动态的和可逆的，但不引起DNA序列发生改变。频发突变的表观遗传学修饰基因包括DNMT3A（DNAnucleotide methyltransferase 3A）、TET2（ten-eleven translocation 2）、IDH1/IDH2 （isocitrate dehydrogenase 1/2）、ASXL1（the addition of sex comds like 1）和MLL1 （mixed lineage leukemia 1）。这些基因突变影响造血细胞的自我更新和（或）分化，并促使向髓系转化，但还不足以导致白血病形成。

    2、AML常见的DNA甲基化和组蛋白修饰异常

    2.1 DNA甲基化相关基因异常

    2.1.1 DNMT3A 突变

    DNA甲基化是表观遗传调节的重要组成部分，通常参与转录沉默。已经证实，在AML中DNA高甲基化并促使一些肿瘤抑制基因发生转录抑制，通过增殖和分化等调控异常促使白血病形成。骨髓增生异常综合征（MDS）的DNA甲基化数据分析显示肿瘤抑制基因的异常甲基化可能在MDS向AML转化的发病机制中占主导地位。DNA甲基转移酶（DNMT）催化胞嘧啶第5位碳原子残基甲基化，产生5-甲基胞嘧啶（5-mC），甲基化的胞嘧啶多位于启动子胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛上。与甲基化的DNA相结合的蛋白质可以识别甲基化的CpG岛的二核苷酸序列，并促进招募染色质重塑蛋白和组蛋白修饰酶，例如组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和组蛋白甲基转移酶（HMT）。

    DNMT3A作为半甲基化模板促成基因组DNA甲基化，DNMT1则维持完整的甲基化。这一过程构成了显著的、可遗传的DNA甲基化模式，有助于辨别AML亚型、判断预后和作为预测治疗反应的生物指标。AML可以整体上呈现低甲基化或高甲基化，提示表观遗传路径的高甲基化或低甲基化在白血病生成中都有重要作用。最近的数据提示DNMT1在白血病干细胞（LSC）中维持DNA甲基化模式，并且是LSC自我更新的必要条件。DNMT3A已经被证实在造血干细胞自我更新和分化中起关键作用。重要的是，在细胞遗传学正常的AML中，体细胞DNMT3A功能缺失性突变的发生率大于30%,其可能与较差的临床预后相关。但AML中DNMT3A基因突变对DNA胞嘧啶甲基化和转录的影响尚不明确，而且单独的DNMT3A功能缺失不足以导致白血病的发生。大部分突变都涉及882位精氨酸的杂合替换，体外研究显示这种替换降低甲基转移酶活性。

    2.1.2 TET2基因突变

    TET双加氧酶家族通过催化5-mC向5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）转化而调控DNA甲基化，进一步阻止能够识别甲基化DNA的蛋白质间的结合，这是DNA脱甲基的关键步骤。TET2功能缺失性突变在细胞遗传学正常的AML患者中发生率约为10%,并且和较差的总体生存率密切相关。TET2基因敲除的小鼠造血干细胞过度自我更新，并发展成类似慢粒单核细胞白血病的髓系恶性肿瘤，但是单独的TET2突变尚足以导致AML.

    2.1.3 IDH1 和IDH2 突变

    DNA甲基化与同源二聚体酶IDH1和IDH2（IDH1 /2）催化的柠檬酸盐代谢密切相关，IDH1/2 催化异柠檬酸盐氧化脱羧为α-酮戊二酸（α-KG）。IDH1 /2获得性功能突变在细胞遗传学正常的AML 中发生率为10%——30 %,其突变导致酶功能异常，促使α-KG产生减少、2-羟戊二酸（2-HG）产生增加。不论是TET2还是含有JmjC结构域的组蛋白赖氨酸脱甲基酶，其功能的发挥都依赖α-KG,IDH1/2突变和2-HG积聚会导致其功能受损，进而导致DNA和组蛋白高甲基化。IDH1/2突变对AML预后影响的研究结论尚不统一，可能是由于突变的位点不一样和（或）伴随突变不同。例如：IDH2的第140位精氨酸残基发生突变以及细胞遗传学正常的AML患者发生NPM1和IDH1或IDH2突变时提示预后良好，在大样本随机试验中显示3年总生存率为89%.值得注意的是IDH1 /2和TET2突变是互相排斥的，但是具有这两种明显不同突变的AML患者具有相似的甲基化过程。

    2.2 组蛋白修饰异常

    2.2.1 MLL 突变

    位于染色体11q23的MLL基因编码H3K4甲基转移酶（HMT），HMT参与组蛋白重塑，影响HOX基因和Wnt信号通路。MLL框架内部分串联重复在初发AML中发生率为5%-7%,提示预后不良，若同时具有嗜亲性病毒整合基因l（EVI1）表达异常时预后更差。MLL区域是染色体易位和重排的高发区域，产生多种融合蛋白，其中有一部分是致肿瘤性的。MLL融合蛋白直接和一些包括HMT D0T1L的表观修饰因子相互影响。HMTD0T1L能够催化H3K79甲基化，相关研究提示MLL融合蛋白和DOT1L的相互作用可促使白血病发生。

    2.2.2 ASXL1 突变

    多梳相关基因ASXL1通过与多梳抑制复合物（PRC2）相结合调控表观遗传基因。PRC2通过使组蛋白3在第27位赖氨酸残基发生三甲基化（H3K27me3）来介导相关基因的转录抑制。ASXL1突变导致ASXL1蛋白表达缺失，降低H3K27甲基化，并减少PRC2与AML发病可能相关的基因结合，导致对这些基因的抑制作用减弱。在AML患者中，ASXL1功能缺失性突变的发生率为6%-30 %,多发生于老年、MDS转化的AML患者中，提示预后不良。

    3、针对表观遗传学异常的靶向治疗

    3.1 DNMT抑制剂

    目前美国食品与药品管理局（FDA）已批准了两种DNMT抑制剂：阿扎胞苷及其脱氧衍生物地西他滨。这两种胞嘧啶类似物在20世纪60年**发，低剂量可抑制DNMT;大剂量地西他滨整合入DNA,大剂量阿扎胞苷整合入DNA和RNA,但具体机制仍不清楚。这两种药物均被批准用于治疗MDS,但基于几个相关的临床试验结果，也已经用于AML的治疗。

    在一项多中心II期临床研究中，共入组227例新诊断的AML患者，在72h内静脉滴注地西他滨 135 mg / m2,每6周重复一次为1个疗程，最多用4个疗程。部分患者在第2个疗程接受了全反式维甲酸治疗，和（或）每4——6周连续3d给予地西他滨每天20 mg/m2维持治疗。不论染色体核型如何，总反应率为26%,中位生存期为5.5个月，1年生存率为28%.

    在另外一个多中心II期研究中，共入组55例AML患者，入组标准为骨髓原始细胞大于20%和年龄大于60岁，地西他滨用量为每天20 mg/m2,连续静脉滴注5d,间隔4周重复一次，CR率为24%,中位生存期为7.7个月。在细胞遗传学提示预后差的AML患者以及有白血病前期病变的AML患者中有较好的治疗反应。

    在另一项III期随机临床试验中，比较了上述相同剂量的地西他滨方案和单纯维持治疗以及小剂量阿糖胞苷方案的疗效，显示地西他滨组的CR率为17.8%,对照组为7.8%,总生存无明显获益，但随后的计划外数据分析显示地西他滨组的生存获益具有统计学意义，这一结果促使欧洲药品管理局批准地西他滨用于AML的治疗。Scandura等报道，地西他滨每天20 mg/m2,连续应用5d 作为表观遗传学预激方案，在传统的柔红霉素联合阿糖胞苷诱导治疗前使用取得了较好疗效。目前，一项标准的DA诱导方案联合或不联合地西他滨预激方案的II期随机临床试验正在进行中。

    在美国进行的一项阿扎胞苷治疗高危MDS（包括骨髓原始细胞比例为20%——30%、按WHO诊断标准诊断为AML的临床试验中，阿扎胞苷以每天75 mg/m2 的剂量连续7d皮下注射，28 d为1个疗程；对照组为传统治疗方案，包括最好的支持治疗、低剂量阿糖胞苷或大剂量化疗。虽然阿扎胞苷的CR率仅为18%、对照组为16%,但阿扎胞苷组有明显的生存获益。在次要结束终点如输血需求、静脉应用抗生素和住院天数等方面，阿扎胞苷治疗组也有改善。

    在法国，给予149例初发老年AML患者相同剂量和周期的阿扎胞苷，结果总反应率为33%,取得CR或者CR但血小板不完全恢复者为23%,总生存期为9.4个月。意大利一个小型研究显示，35例初治AML患者应用相同剂量和周期的阿扎胞苷治疗后取得相似的疗效，CR率为31%,总生存期为9个月。和地西他滨治疗一样，大多数对阿扎胞苷治疗有反应的AML患者，继续接受阿扎胞苷维持治疗，直到出现病情进展或不可耐受的毒性反应。在AML强化诱导化疗和异基因造血干细胞移植之后，使用阿扎胞苷维持治疗能够降低或推迟复发。

    3.2 HDAC抑制剂

    单独应用HDAC抑制剂治疗MDS和AML表现出有限的临床价值，但是联合应用DNMT抑制剂通过解除转录抑制显示出协同效果。多种HDAC抑制剂，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立诺他等联合阿扎胞苷或地西他滨的临床试验正在进行，但是目前的结果令人失望。例如：Entinostat联合阿扎胞苷治疗149例MDS和AML的II期随机试验结果显示并没有提高反应率。值得注意的是，在这个试验中这两种药物是同时应用的，而体外实验显示先给予DNMT抑制剂再序贯给予HDAC抑制剂才能达到最佳的协同作用。Entinostat是强效细胞周期抑制剂，可能阻止阿扎胞苷的整合，导致初始去甲基化作用减弱。

    3.3 IDH1/2抑制剂

    针对IDH1/ 2突变酶的小分子靶向抑制剂治疗携带IDH1 / 2突变的AML患者的早期临床试验正在进行中。此抑制剂可以减少2-HG的产生，诱导H3K9me3去甲基化，增加有关分化基因的表达。

    3.4 DOT1L蛋白甲基转移酶抑制剂

    相关研究已证实D0T1LHMT的酶活性可促使有 MLL重排的个体产生白血病。D0T1L抑制剂可以降低H3K79甲基化和MLL融合靶向基因表达。一个强效、高度选择性的D0T1L抑制剂已经进入临床试验。强效选择性HMTEZH2抑制剂也正在研发中。

    3.5 赖氨酸乙酰化抑制剂

    结构域蛋白质能够识别蛋白末端的赖氨酸残基，这一过程可被小分子抑制剂所阻止。几种BET抑制剂临床试验正在进行中，研究结果显示其能够阻止白血病细胞、干细胞和祖细胞增殖，阻断MLL介导的白血病转化。

    3.6 赖氨酸去甲基酶抑制剂

    在体外实验中，KDM1A/***1抑制剂可有效对抗白血病细胞系和原代白血病细胞，特别是与HDAC抑制剂和全反式维甲酸联合使用时作用更为显著。尽管体外实验显示KDM1A/***1抑制剂对MLL白血病最效，AML 的其它亚型以及其它髓系恶性肿瘤对其也比较敏感。目前KDM1A/***1抑制剂治疗AML和MDS的临床试验正在进行中。

    4、靶向表观遗传学异常所面临的挑战

    4.1 治疗把点的选择

    AML 是由一系列异常因素引起的疾病，疾病本身存在的多种异常可以成为治疗的靶点，包括表观遗传通路失调控、基因突变、细胞表面标志、信号转导通路、LSC和骨髓微环境等。最近对AML克隆构型的研究发现，AML克隆异质性随着疾病的进展和复发而变化，使得AML的治疗靶点具有移动性和多变性，在疾病的不同阶段治疗靶点不同。例如不同的初发AML患者的LSC、原始细胞和干细胞具有遗传学和表观遗传学的异质性，化疗后存活下来的白血病细胞的克隆性会发生变化。用全基因组捕获测序技术研究初发AML标本的克隆构型，发现从遗传学角度定义的亚克隆和LSC之间有明显的功能异质性。因此靶向治疗的关键是如何识别并根除所有的克隆，而不是通过高度选择的单向靶点来消除优势克隆。

    4.2 治疗人群的选择

    治疗人群的选择是一个复杂但是绝对关键的问题。可以把AML分为很多亚组，但每种分类法都有优势和劣势。比如可以根据年龄把AML患者分为小于60岁的年轻患者和大于60岁的老年患者。这种武断的分类往往只是为了界定患者能否耐受大剂量化疗，然而随着支持治疗的进展和“老年人”体能状态的改善，越来越证明不能单凭年龄指导治疗方案的选择。不过年龄仍然是重要的预后因子，临床医生以及管理部门已经习惯于根据年龄分组来判定某种新治疗措施的有效性。因此，在一个耐受良好、能够消除年龄影响的“魔幻***”出现之前，年龄仍将会是影响AML临床试验的一个重要参考因素。

    也可以按预后对AML进行分类。一种新药的早期临床试验往往是在复发难治的患者中进行，但这又是一种令人沮丧的模式，因为有些新药很难在复发难治的AML患者中显示出疗效，并由此退出进一步的研究。由于复发难治的AML在生物学上和临床上明显不同于初治AML,因此新药的研究应该在初治患者中进行。新诊断的接受标准方案治疗的AML患者可以用包细胞遗传、分子遗传学和表观遗传学进行危险度分层、判定其预后。一项研究显示七个基因在不同甲基化区域有高水平甲基化，但表达水平减低是***于年龄的临床预后良好的因子。因此，那些新诊断的、用常规方案治疗预后可能较差的患者应该是临试验的受试对象。

    理想的涉及表观遗传学异常的靶向治疗的临床试验，应该通过预测性生物学指标选择临床试验受试者，联合应用相应的表观修饰药物进行治疗。但实际上绝不是如此简单。例如尽管已知氮杂核苷抑制DNMT,但是并不清楚其有效性与这种作用机制相关的程度如何，而且，直到目前应用甲基化模式去预测反应率或指导治疗都没有成功。不过，携带DNMT3A突变的AML患者对地西他滨有良好的反应。

    如何选择患者群体也是个难题。如果根据白血病生物学特点的假设选择了“特定”的患者亚群参加临床试验，患者的获益具有挑战性，但可能错失了一些因为不确定因素未能入组但对药物可能有良好反应的患者。另一方面，如果对没有选择的AML患者给予精准靶向药物治疗，可能观察不到靶向药物的获益，除非受试人群碰巧具有药物作用靶点。

    4.3 治疗时机的选择

    AML治疗包括诱导、巩固和缓解后治疗。尽管氮杂核苷可以适当提高AML的总生存率，但没有CR获益。作为治疗目标应该保留CR这一试验终点，因为CR与患者的总生存和生活质量密切相关。

    因为针对表观遗传异常的靶向药物与其他药物合用要比单用能产生更大的获益，所以已经考虑在传统的“基石诱导方案”基础上添加试验新药。例如：英国医学研究委员会确定了小剂量阿糖胞苷作为老年AML的标准诱导方案，在基石方案中添加针对表观遗传学调控的新药的临床试验正在进行中，称为“Pick-A-Winner”计划。因为DNMT抑制刺联合其他表观抑制剂可能达到更好的疗效，美国已考虑阿扎胞苷75 mg/m2 x 7 d联合地西他滨20 mg/m2 x 10d 作为AML患者标准诱导治疗方案，对于不能耐受大剂量化疗的老年AML患者也可以釆取上述联合诱导方案。

    鉴于至今没有更强烈的化疗方案优于阿糖胞苷联合蒽环类药物的“7+3”方案，此方案应作为诱导缓解方案的基石，新药可以加入到“7+3”方案中或作为单药评估疗效，参加临床试验的初治患者随机接受三种方案中的一种进行治疗。这样就可以通过消除不必要的生物异质获得“真实世界”      的诱导缓解治疗。

    不管用何种药物诱导治疗，诱导后残余的白血病细胞不同于在生物治疗之前。因此，目前重复同一化疗方案进行巩固治疗是不恰当的。在化疗后或移植后釆用表观遗传学靶向治疗有可能控制缓解后的白血病克隆演变。迄今为止，这些靶向表观遗传学的复合物大部分都是非细胞毒药物，因此更适用于白血病负荷低的疾病状态，此观点尚需大样本AML患者参与的临床试验来证实。

    4.4 有效性的评定

    针对表观遗传学异常的靶向治疗可能需要长期监测疗效，往往需要数周或数月才能显示疗效。例如DNMT抑制剂治疗后数月才能观察到完全缓解，而基于标准的形态学、免疫表型的评价标准可能不足以评价这些药物的疗效。目前人们正在努力尝试通过DNA甲基化特征、基因表达谱、质谱分析法和其他技术来寻找可以预测疗效、监测疾病的生物学标志。

    4.5 联合治疗

    尽管阿扎胞苷和地西他滨单药治疗AML的疗效是毋庸置疑的，但关于这类药物的最佳剂量、周期、联合模式和持续时间等都尚待摸索，多种小规模、单药、单机构的I期和II期研究不足以明确回答这些问题。许多研究药物如HDAC抑制剂和溴结构域蛋白抑制剂的联合应用有望施于临床试验。

    5、小结

    对AML表观遗传修饰基因重现性突变的认识揭示了表观遗传学在AML生物学方面的关键性和复杂性作用，已经启动了针对表观遗传学异常的靶向治疗。但是，AML生物学和AML患者的高度异质性使表观遗传学靶向治疗面临严峻的挑战。尚需有更多的临床医生和患者自愿参加、有相关基础研究支持、合理的临床试验来证实表观遗传学靶向治疗的疗效。