【PDF】蛋白质纯化实验参考手册 - 医学资源下载
资源作者：deyixu
资源分类：医学 - 基础医学
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上传日期：2012-10-22 08:07:20

蛋白质纯化实验参考手册.pdf 第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件 1. PCR 引物设计的基本原则 （1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 1520 。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C 含量 宜在 4555% 左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。 （5）引物 3’末端一般以单个 C 或 G 结尾。 2. PCR 反应组分和条件 PCR 反应体系一般选用 50 μl 体积，其中含有： 10×Reaction buffer，5 μl 2 个引物，各 12.525 pmol (终浓度各 0.250.50 μmol/L) 4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L 模板 DNA，100 ng 左右 Taq DNA 聚合酶，2.53 U PCR 反应条件一般为： （1）94℃，5 分钟 （2）94℃变性 3060 秒 （3）5055℃ 退火 3060 秒 （4）7072℃ 延伸 3060 秒 （5）72℃ 5 10 分钟 共进行 2535 次循环。循环是步骤（2）和（4） (二) 质粒 DNA 的小量制备 3 1、传统方法 （1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。 （2）在每个 EP 管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1 分钟以收集 菌体。 （3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I 中，并加入 200 μl 新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 67 次，然后，冰浴 5 分钟。 （4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 56 次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。 （5）12,000 rpm 离心 10 分钟后，小心吸取上清至另一 EP 管中。 （6）加 2 倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5 分钟。 （7）12,000 rpm 离心 5 分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA 沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA 纯化方法 离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460 及 A1470） （1）12,000 rpm 离心 1 分钟，以沉淀 110 ml 过夜培养物。 （2）用 250μl Cell Resuspension Solution 充分悬浮大肠杆菌细胞。 （3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 56 次混合。 （4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 56 次混合，室温放置 5 分钟。 （5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 56 次混合。 （6）室温，最高转速离心 10 分钟，回收上清。 （7）将离心柱插入收集管中。 （8）将上清倒入离心柱中。 （9）室温，最高转速离心 1 分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。 （10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1 分钟，倒掉流穿液，将 离心柱重新插入收集管中。 （11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。 （12）室温，最高转速离心 2 分钟。 （13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml 微量离心管中。 （14）在离心柱中加 50100μl NucleaseFree Water，室温，最高转速离心 1 分钟。

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