作者：程亮

    非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%,外科手术是最有效的治疗方法，但仅适用于NSCLC中的一小部分无或局限性转移的患者，并且很多患者手术治疗后仍会复发转移。近年来表皮生长因子受体（EGFR）在肺癌致瘤中的作用以及针对EGFR的靶向治疗备受关注，病理学家在如何筛选合理的EGFR靶向治疗对象及判定检测结果中起着关键的作用。本文总结了EGFR突变、基因拷贝数、EGFR过表达、磷酸化以及EGFR通路下游靶基因改变在预测NSCLC患者EGFR靶向治疗疗效最新研究成果。同时阐述了KRAS和BRAF突变以及ALK基因重排在肺癌靶向治疗中的作用。

    一、EGFR概述

    EGFR及其家族成员通过调节细胞增生、凋亡、迁移及肿瘤血管生成发挥重要的致癌作用。EGFR信号分子改变涉及多种恶性肿瘤发生、发展。尽管EGFR突变通过何种信号途径致癌的机制还不完全清楚，但明确的是EGFR突变能增强酪氨酸蛋白激酶活性。人类癌症相关体细胞突变目录 （COSMIC）中提供了有关NSCLC有意义的基因突变及靶向治疗耐药相关的突变基因信息（COSMIC, <http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/add_***/>）。EGFR基因位于7号染色体短臂7p12区，全长200kb,包含28个外显子，是编码464个氨基酸的蛋白质。它的活化依靠与其配体结合。配体一旦与EGFR结合，受体形成同源或异源二聚体，活化自身酪氨酸蛋白激酶。配体结合引起的受体二聚化可导致胞内酪氨酸残基自身磷酸化，磷酸化是下游信号的关键分子事件。EGFR可以激活下游多种信号途径，参与调节细胞增殖，分化，迁移以及存活（图 1）。EGFR在许多实体肿瘤的生长和存活中发挥着重要作用。EGFR 突变影响EGFR活化及过表达，而导致肿瘤的发生。 EGFR受体酪氨酸激酶可以通过两个信号通路调节细胞增殖与存活：PI3K/AKT/mTOR信号通路以及 RAS/RAF/MEK/MAPK信号通路。这些下游信号途径参与调节细胞增殖、凋亡、迁移、存活等重要生理过程，也参与调节肿瘤血管生成及肿瘤形成（图1）。

    基于EGFR 基因激酶域基因突变理论研制的针对EGFR酪氨酸激酶的靶向药物治疗给NSCLC患者带来了新的治疗契机。抗EGFR的靶向治疗主要有两种方式：EGFR单克隆抗体（如Cetuximab、Panitumumab）以及小分子EGFR酪氨酸激酶拮抗剂（EGFR-TKI）。大规模III期临床试验结果显示临床有效率15%到37.5%.临床试验表明多种有EGFR突变的肿瘤对EGFR-TKI敏感，临床有效率10%-30%.应用最广的EGFR-TKIs是吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）。这类药物是可逆性抑制剂，它们通过竞争ATP结合在EGFR-TK上的活化位点发挥作用， 主要用于铂类药物化疗失败的病人 .已有222篇相关文献证实EGFR 突变可预测晚期NSCLC患者EGFR-TKI单药疗效。

    图 1: EGFR 及其信号通路 EGFR单体胞外段有两个配体结合域：一个是跨膜亲脂结构域和第18号到24号外显子的胞内酪氨酸激酶结构域。配体与EGFR结合促进胞内酪氨酸残基自身磷酸化，激活自身酪氨酸激酶而活化。EGFR活化驱动了一系列信号途径活化。主要有两条通路参与调节细胞增殖和存活：PI3K/AKT/mTOR信号途径和RAS/RAF/MEK/MAPK信号途径。这两个信号途径参与调节细胞周期，引起细胞增殖，凋亡，迁移，存活以及血管生成等。

    二、 EGFR原癌基因突变、DNA拷贝数、蛋白表达以及EGFR下游信号分子的改变和NSCLC患者EGFR靶向治疗的关系2.1 EGFR突变

    EGFR突变可使TK受体组成性活化，并与EGFR-TKIs敏感性相关。伴有这些突变的患者接受Erlotinib或Gefitinib治疗后反应率常大于70%.受体的不同突变位点具有不同的特点，而大多数突变会影响ATP结合位点，这也是TKI针对的靶点 （图2）。

    体外实验表明EGFR突变增强TK活性，从而提高了肿瘤细胞对EGFR抑制剂的敏感性。研究发现TKI治疗有效者常有EGFR基因第19号及21号外显子突变，这些基因突变可用于筛选EGRF靶向治疗对象。最常见的突变是第19 号外显子上第745密码子开始缺失4个高度保守性氨基酸（LREA）。EGFR 突变者TKI治疗有效率及无病生存期明显好于无突变者。

    目前检查突变最常用方法包括直接测序法及实时定量PCR,其它还有聚合酶链式反应-单链构象多态（PCR-SSCP）分析和高分辨率熔解曲线分析（HRMA），蝎形探针扩增阻滞突变系统及多靶实时定量PCR检测试剂盒用于检测肿瘤中常见的EGFR体细胞突变。这些敏感性和特异性高的试剂盒即使在混有野生型基因组DNA情况下，也能有效地检测出EGFR突变。DxS Scorpions?技术可检测第19号外显子缺失突变（T790M, L858R, L861Q, G719Xs, S768I）以及外显子中的3个插入突变 （2307_2308ins9, 2319_2320insCAC和2310_2311insGGT）。与直接测序相比，其它两种方法在快速检测EGFR突变上具有更高的特异性及敏感性。但临床仍需应用直接测序验证基因突变。目前国际上无EGFR基因突变检测的指南，在检测步骤中还需说明EGFR突变位点的检测数目。Jackman等发现223例未接受化疗的晚期NSCLC患者中，EGFR 突变者TKI治疗反应率为67%,疾病恶化时间为11.8个月，总体生存时间为23.9个月。与第21号外显子L858R点突变相比，第19号外显子缺失具有更长的中位疾病恶化时间及总体生存时间。无论KRAS突变状态，野生型EGFR突变预后常较差 （治疗反应率，3%;疾病恶化时间，3.2个月）。对于筛选EGFR-TKI一线治疗对象的指标而言，EGFR 基因型优于临床参数。

    图2:EGFR活化突变以及EGFR靶向治疗的机制  EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶组成性活化。活化的EGFR磷酸化激酶域的酪氨酸残基，从而激活下游效应子。EGFR靶向治疗两种方式：人源化的抗体（Y）以及酪氨酸激酶小分子抑制剂或TKIs （X）。抗体通过阻止配体与EGFR结合，抑制EGFR配体依赖的活化。TKIs通过阻止ATP与酪氨酸激酶胞内端结合，抑制EGFR自身磷酸化。抑制酪氨酸激酶活性，干扰了下游信号途径的活化。

    研究表明大于75%EGFR-TKI治疗有效者具有EGFR突变活性。但是，一些伴有EGFR常见突变的二次突变常常对EGFR-TKI靶向治疗有耐药性。EGFR基因第20外显子突变常对Gefitinib治疗无反应。而且，第20外显子二次突变T790M占获得性耐药的50%.外周血循环肿瘤细胞的耐药性突变位点的检测可早期确定是否具有获得性耐药。

    一些临床前期试验表明EGFR-TKIs疗效获益不仅仅局限EGFR基因突变者。可能突变基因以外的分子机制也发挥着一定作用。EGFR基因扩增以及受体/配体过表达等与EGFR抑制剂单药敏感性相关 .但IPASS临床试验显示EGFR基因拷贝数增加而无EGFR基因突变患者对EGFR-TKI治疗不能获益。

    2.2 EGFR 拷贝数的改变

    NSCLC中EGFR基因扩增较常见，并常伴EGFR蛋白过表达。基因扩增和7号染色体多倍体均可导致EGFR基因拷贝数增加。由于个体差异及实验技术的差别，EGFR扩增发生率12%-59%.部分研究表明EGFR基因的扩增常与TKI治疗后生存率高相关。EGFR 基因拷贝数增加常与TKI治疗预后好相关。因此，基因拷贝数的增加可以作为预测TKI治疗反应性的一项指标。

    EGFR体细胞突变与治疗反应率正相关具有肯定的结论。但EGFR基因拷贝数与EGFR-TKIs治疗反应性的关系尚未取得一致性的结果。总之，对于预测TKIs治疗反应性，EGFR 突变比EGFR基因获得状态更特异、更敏感[9].采用FISH检测EGFR拷贝数发现30%的NSCLC有EGFR高拷贝数，虽然这些患者的EGFR突变状态不清楚，但EGFR高拷贝数与TKI治疗反应性好相关。约70%EGFR高拷贝数患者同时伴有EGFR体细胞突变，这一点混淆了EGFR高拷贝数的真正意义。 IPASS临床试验显示EGFR突变是延长无进展生存期最有效的预测因子。有些学者认为EGFR基因拷贝数可用作预测NSCLC患者EGFR TKI疗效反应及生存获益的指标[16].但是IPASS临床试验证实EGFR基因高拷贝数而无EGFR基因突变患者对EGFR-TKI治疗不能获益。Hirsch等认为尽管EGFR突变及基因高拷贝数均能预测NSCLC患者Erlotinib疗效，而EGFR拷贝数是预测不同患者Erlotinib治疗生存获益更有利的指标。

    检测EGFR基因拷贝数方法包括FISH,显色原位杂交（CISH），实时定量PCR （qPCR）。采用PCR检测EGFR 基因拷贝显示EGFR拷贝数增加与生存期延长显著相关，提示其潜在的预后价值[9,21].EGFR 基因获得可使疾病控制率从26%提高至67%,疾病进展期从2.5个月延长至9.0个月，生存时间从7个月延长至18.7个月。值得注意的是EGFR基因拷贝数作为预测TKI疗效的原因主要是其与EGFR突变相关。EGFR 突变是最好的疗效预测因子。Hirsch等进行的229例未经化疗的晚期NSCLC患者II期临床试验发现，如果FISH以多于40%的肿瘤细胞出现4个或更多拷贝数界定为拷贝数增加，76例患者中59.2%有EGFR基因拷贝数增加。EGFR有扩增患者（45%）对治疗的反应好于无扩增者（26%）。有EGFR 扩增患者的中位无疾病进展期为6个月，而无EGFR扩增的为3个月。EGFR有扩增组的中位整体生存时间为15个月，而无EGFR的扩增组仅为7个月。

    尽管大部分研究显示NSCLC患者EGFR基因高拷贝数与EGFR-TKIs治疗反应好及生存期长相关，但对其是否具有预后价值仍存在争论。有些研究认为作为筛选靶向治疗病人的预测指标，EGFR基因拷贝数的敏感性和特异性均劣于EGFR突变。Douillard等也证实作为治疗反应性及无疾病进展期的预测因子，EGFR突变优于EGFR拷贝数。

    2.3 EGFR 蛋白过表达

    尽管EGFR过表达的研究非常多，但结果却不尽如人意。40%-80%NSCLC患者有EGFR蛋白过表达，并且与预后差相关。最初设想EGFR抗体对治疗EGFR过表达患者可能有效。但早期临床试验提示EGFR过表达与抗EGFR抗体疗效无明确相关性。此外，应用免疫组织检测EGFR表达不能作为预测Cetuximab靶向治疗疗效的可靠手段。

    部分研究显示免疫组化检测EGFR过表达与TKI治疗反应性好相关，但其它研究无类似结果。多因素分析显示EGFR表达水平与NSCLC治疗客观反应性及不良预后相关[18].几项预后研究发现EGFR表达与生存获益不相关。因此，EGFR过表达不能作为NSCLC生存预测因子。不同研究结果之间的差异可能是由于免疫组化EGFR阳性判定的临界值及实验步骤无标准化指南有关。

    2.4 EGFR磷酸化

    EGFR异常活化在肿瘤发展及演进中发挥着重要作用。此外，最新研究表明EGFR突变及EGFR磷酸化活化状态可影响NSCLC患者临床经过。两种主要EGFR信号途径：（PI3K）/Akt/mTOR和Ras/Raf/MAPK均参与EGFR引起肿瘤细胞增殖与存活。这些信号途径的活化依赖关键信号分子磷酸化的活化。NSCLC最主要的致瘤分子机制是活化性突变。调节EGFR表达的机制如表观遗传学及异常转录因子的研究尚未得出肯定结论。MicroRNA是EGFR调节因子。Weiss等检测3株NSCLC细胞株及NSCLC患者发现2株细胞株及55%的NSCLC患者有microRNA-128b的缺失。并且他们认为microRNA-128b可直接调节EGFR表达，microRNA-128b缺失与Gefitinib疗效好及生存期长相关。

    EGFR激酶域第845位酪氨酸磷酸化可以稳定EGFR活化环，维持受体活化状态，提供与底物蛋白结合的位点。EGFR上另外两个酪氨酸磷酸化位点1068和1173可直接与GRB2直接结合，而且第1068位酪氨酸参与MAPK信号途径的活化。

    EGFR活化可以通过抗EGFR磷酸化抗体检测EGFR磷酸化状态。EGFR基因C端磷酸化在募集信号分子及活化下游信号途径中发挥着重要作用。Endoh等短时间随访97例 NSCLC患者发现，EGFR磷酸化抗体阳性患者生存期更长。Hijiya等应用免疫组化方法检测抗 992及1173酪氨酸磷酸化抗体在21例NSCLC肿瘤组织表达情况，他们发现第992位酪氨酸磷酸化与EGFR基因突变相关密切，提示EGFR磷酸化抗体可替代EGFR突变检测，作为预测酪氨酸激酶抑制剂的疗效的指标。所以NSCLC患者应用免疫组化方法检测EGFR磷酸化状态可潜在预测EGFR靶向药物的疗效，但仍需进一步临床验证。

    2.5 EGFRvIII

    EGFRvIII,一种最新发现的EGFR缺失突变体，是基因重排或mRNA剪切错误所致的第2至第7外显子编码序列框内缺失突变体。这种突变体比野生型EGFR少了267个氨基酸，在融合位点上形成了一个新的多肽。研究表明EGFRvIII突变体和野生型EGFR功能不同。尽管EGFRvIII不能与EGF等配体结合，但其自身酪氨酸激酶可组成性活化，受体自身磷酸化。 NSCLC常有EGFRvIII表达，且表现为活化的磷酸化状态。因此，持续活化的EGFRvIII可能在肺癌发病中发挥重要作用，同时也可作为抗肺癌药物的潜在靶点。 针对EGFRvIII的特异性抗体也可用于肺癌的靶向治疗。EGFRvIII特异性单克隆抗体可以抑制EGFRvIII高表达小鼠肿瘤细胞的生长，提高小鼠生存时间。EGFRvIII特异性抗体只与EGFRvIII突变体结合，不能与野生型EGFR结合，因此应用EGFRvIII抗体能更好的检出EGFRvIII突变体。

    EGFRvIII突变体在NSCLC发病中的作用仍不太清楚。文献中报道EGFRvIII突变体在NSCLC患者检测率为0到42%.这些差异可能是由于检测肿瘤的组织学类型不同或者技术误差造成。免疫组化检测发现EGFRvIII突变体还存在于其它许多肿瘤。但是由于EGFR基因长、基因组结构复杂（含28个外显子，全长 约为190 kb）、第1内显子长（123kb）并且常发生基因缺失，因此在基因水平检测EGFRvIII突变非常困难。Okamoto等应用免疫组化检测EGFRvIII突变单克隆抗体在76例NSCLC的表达情况，发现EGFRvIII在39% （30/76）的NSCLC中表达；而基因分析检测EGFRvIII突变体仅为3%.他们还发现EGFRvIII也可以在正常肺组织中表达，因此对免疫组化检测 EGFRvIII突变产生了质疑。

    研究证实了小分子TKIs对有EGFR激酶突变NSCLC患者的临床靶向治疗有疗效。但是，这些小分子抑制剂是否能针对EGFRvIII突变尚不清楚。Ji 等[32] 报道EGFRvIII突变在人肺鳞癌中的表达率为5% （3/56），但肺腺癌（0/123）中却无EGFRvIII突变。他们同时发现EGFRvIII突变的肿瘤对某些TKI有耐药性，而对另一些TKI却有反应性。体内实验证明，加入不可逆的EGFR抑制剂HKI-272一周后能明显缩小EGFRvIII致瘤小鼠的肿瘤体积。Erlotinib处理3只小鼠7天，肿瘤体积平均减少45%.而HKI-272处理后，肿瘤体积平均减少88%.转染EGFRvIII 突变体的Ba/F3细胞对Gefitinib和Erlotinib耐药，而对HKI-272较敏感。因此，应用TKI对有EGFRvIII突变的肺癌患者具有潜在疗效。

    三、EGFR 检测和靶向治疗

    由于EGFR 过表达作为预后因子的研究缺乏重复性，研究者致力于EGFR突变型特异性结合的抗体的研制。Cell Signaling公司（Danvers, MA）研制出两种针对EGFR最常见突变位点的特异性抗体：第19号外显子 15-bp/5-氨基酸缺失突变（E746-A750del）和第21号外显子 L858R点突变。 Yu 等用这两种抗体采用免疫组化的方法检测40例NSCLC标本中EGFR突变的基因型，并且每例均用DNA测序验证。这两种抗体也可用于Western blotting、免疫荧光以及免疫组化染色。在340个石蜡包埋的NSCLC标本中应用这两种抗体，与DNA直接测序及质谱DNA测序相比，其敏感性和特异性分别为92%和99%.这表明应用突变特异性抗体是筛选预测肺癌患者EGFR靶向治疗疗效的一个快速、敏感、特异及经济有效的方法。Brevet 等应用这两种EGFR突变特异性单克隆抗体在218例肺腺癌石蜡组织中进行免疫组化检测，发现采用1+为阳性临界值，EGFR L858R点突变抗体的敏感性为95%,阳性预测值为95%;若采用2+为阳性临界值，抗体的敏感性为76%,而阳性预测值为100%.因此，免疫组化检测EGFR突变特异性抗体可以用于筛选EGFR靶向治疗对象。

    笔者提出的非小细胞肺癌患者分子检测流程（图3）。 按肺癌突变的频率逐步进行分子检测，并对肺癌患者进行评估，从而给予相应的靶向治疗。
 

    图3:小细胞肺癌分子检测的流程  根据不同分子突变的频率建议病人逐级检测。非小细胞肺癌占所有肺癌85%,可检测EGFR突变。EGFR突变阳性，白种人占20%,东亚人占40%,EGFR TKI靶向治疗有效率为80%. 无EGFR突变，白种人占 80%,东亚人占60%.这些病人进一步检测EML4-ALK突变，EML4-ALK 突变仅占NSCLC人群的3%,这类突变患者对靶向治疗有效率为53%.无EML4-ALK突变还可进行其他分子检测3.2 EGFR 靶向治疗

    两种方法可以抑制EGFR信号途径：一种是通过EGFR单克隆抗体阻止配体与胞外域结合，另一种是应用小分子抑制胞内酪氨酸激酶活性。后者首先应用于临床。EGFR-TKIs是通过可逆的竞争性抑制ATP与EGFR-TK域的结合而发挥作用。体细胞EGFR活化突变，基因拷贝数增加，某些临床病理特征等与NSCLC患者靶向治疗疗效好和预后佳密切相关。但这些患者的大部分都具有EGFR-TKIs 获得性耐药。EGFR基因二次突变位点T790M、表达HGF、PTEN和/或EGR-1以及上皮间质转化（EMT）均与EGFR-TKI耐药相关。Uramoto等发现8个T790M突变病例中6个高表达HGF,3个（38%）病例有PTEN缺失。7个病例中2个（29%） 有EGR-1缺失，其中一个有PTEN缺失。7个病例中4个（57%） 表达磷酸化Akt （p-Akt）。9个病例中4例（44%）在治疗过程中出现上皮间质转化（EMT）。因此EGFR-TKIs 耐药机制涉及基因、蛋白等多因素的改变。

    部分EGFR体细胞活化突变的NSCLC对酪氨酸激酶抑制剂具有反应。如上所述，获得性耐药与EGFR二次突变位点T790M相关。Bell等[20]报道一个家族中多个NSCLC的发生均与EGFR T790M突变相关。EGFR信号通路的改变是家族性NSCLC遗传易感的罪魁祸首，使家族肺癌患者增加。

    3.2.1单克隆抗体

    Cetuximab和Panitumumab是人/鼠嵌合或完全人源性抗EGFR胞外域单克隆抗体，它们通过抑制活化的配体与EGFR的结合而发挥作用。这种靶向治疗通过抑制配体依赖的EGFR的活化，从而抑制下游信号途径活化，达到缩短细胞周期进程、抑制细胞生长以及血管生成（图2A）。此外，EGFR单克隆抗体还能促进EGFR内化、降解，终止EGFR信号途径[26]. 完全人源性抗体Panitumumab与EGFR亲和力高，其半衰期更长。尽管NSCLC患者常表达EGFR,但抗EGFR抗体仅对部分患者有效。

    3.2.2 酪氨酸激酶抑制剂

    TKIs是人工合成的小分子，通过与ATP竞争性结合EGFR TK域。Gefitinib和Erlotinib是针对EGFR特异的酪氨酸激酶抑制剂，但同时也可抑制其他受体，如HER2和VEGFR2.TKIs通过结合酪氨酸激酶，阻断EGFR分子内自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，阻止胞内下游信号途径的活化（图 2B）。

    四、EGFR靶向治疗耐药性机制

    4.1 二次突变引起的获得性耐药

    尽管EGFR突变与Gefitinib和Erlotinib高敏感性相关，但仍有部分EGFR突变患者对EGFR-TKI治疗并不敏感。EGFR-TKIs耐药性可分为原发性耐药和治疗后引起继发性耐药。大部分病人对 Gefitinib和Erlotinib初始治疗敏感，但最终可发展为耐药及疾病进展。

    TKI药物敏感性相关的突变主要有四种：第18外显子点突变 （G719A/C）、第21外显子点突变 （L858R和L861Q）以及第19 号外显子从第745位赖氨酸残基缺失4个高度保守性氨基酸（LREA）的框内缺失突变。此外第20外显子D770-N771插入突变也与EGFR-TKI耐药性相关。体外实验证实第20外显子插入突变对EGFR-TKIs反应性比第19和第21外显子点突变弱。

    获得性耐药机制包括两个方面：其一是在治疗过程中EGFR基因出现了二次突变革变了EGFR蛋白质编码序列，其二是出现了其它原癌基因的扩增。

    Kobayashi等报道一名接受Gefitinib治疗达完全缓解，两年后复发的NSCLC患者，其复发的肿瘤细胞除了有服药前的EGFR突变位点外，第20外显子上又出现了二次突变位点T790M.基因构象及生物化学的分析表明二次突变可导致Gefitinib耐药。Pao等几乎同时发现相同的突变位点T790M导致Gefitinib 或Erlotinib获得性耐药。Gefitinib耐药病例EGFR激酶域均有T790M二次突变。第790位密码子被称为“管家密码子”, 它决定了抑制剂与EGFR上ATP结合位点的特异性。EGFR第790位突变为甲硫氨酸，使EGFR空间结构改变，阻止与TKIs Gefitinib或Erlotinib的结合，产生耐药。 这个突变位点有利于肿瘤细胞存活，也可作为筛选TKI靶向治疗耐药基因的指标。这些耐药基因的发现推动了不可逆的EGFR-TKI靶向药物的发展，寻找更好的针对耐药的靶向药物。

    EGFR下游癌基因KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN的活化在治疗反应中作用也成为研究热点。EGFR下游主要信号途径RAS/MAPK和PI3K/AKT均参与调节细胞增殖及存活。EGFR下游信号途径的突变也可导致EGFR-TKI耐药。 研究发现MET激酶的扩增以及EML4-ALK 融合基因的突变，可激活RAS/RAF/MEK通路，使EGFR抑制剂产生耐药。

    4.2 KRAS 突变

    KRAS 在EGFR信号通路中发挥着重要作用，原癌基因KRAS编码的G蛋白是EGFR等生长因子活化下游Ras/MAPK信号通路的重要蛋白。

    结直肠癌诊治最重要的发现之一是KRAS的突变状态与抗EGFR单克隆抗体（Panitumumab和Cetuximab）的靶向治疗疗效相关。部分肿瘤有KRAS基因第2号外显子体细胞突变，RAS-GTP水解为GDP,激活RAS信号途径。在KRAS突变的肿瘤中，KRAS蛋白持续活化，可以不依赖上游EGFR信号，从而对EGFR靶向药物Cetuximab或Panitumumab不敏感。

    KRAS突变在肺癌患者中占15%-30%,在TKI治疗无效者中约占35%-45%.大约30%的肺腺癌具有KRAS活化突变，与EGFR-TKI耐药相关[40].值得一提的是，KRAS突变在肺癌中比较常见，但是KRAS和EGFR突变同时存在却很少见。KRAS和EGFR突变很少同时出现在同一类型的肿瘤中，提示这些信号分子对NSCLC的发生和发展起着重叠作用。但是，越来越多证据显示少数情况下EGFR和KRAS突变可以同时存在。 由于这种情况罕见，很难得出肯定结论，但是目前研究认为EGFR/KRAS突变与EGFR-TKI疗效负相关。

    关于KRAS突变是否可以用于评估EGFR靶向治疗仍不清楚。尽管KRAS突变与EGFR-TKI治疗无反应相关，但与无疾病进展时间以及总体生存时间关系尚不清楚。小样本临床试验证实KRAS突变是接受EGFR-TKIs治疗的负相关预测因子，由于KRAS突变发生率低，目前缺乏大规模临床试验进一步验证。一些研究表明NSCLC中KRAS突变可作为抗EGFR单克隆抗体疗效的负相关预测因子，也在TKI耐药中发挥作用。与结直肠癌不同，在肺癌中KRAS突变不能作为筛选抗EGFR单克隆抗体治疗不能获益患者的指标。

    KRAS突变出现在第2号外显子第12和13密码子，激活EGFR非依赖的胞内信号转导。Eberhard等[45]应用测序检测274位肿瘤患者EGFR第18-21号外显子和KRAS第2外显子突变情况，发现KRAS突变占21%,与Erlotinib联合化疗治疗后患者疾病进展时间及生存时间缩短相关。但有些报道认为KRAS突变不影响EGFR-TKI治疗效果。一项关于Erlotinib或Gefitinib单药治疗223例未接受化疗的进展期肺癌患者的研究发现，EGFR突变与67%治疗反应率相关。无论KRAS突变状态如何，野生型EGFR患者均与不良预后相关。

    Wang等应用PCR-限制性片段长度多态性检测273位NSCLC患者KRAS基因12,13密码子突变[47],120位患者接受了EGFR-TKI靶向治疗，KRAS突变患者中仅5.3% （1/19）对治疗有反应，而无 KRAS突变患者治疗反应率为29.7%.KRAS突变患者中位无疾病进展期为2.5个月，而野生型KRAS患者中位无疾病进展期为8.8个月。

    Linardou等应用Meta分析得出 KRAS体细胞突变是晚期肺癌患者接受EGFR-TKI单药治疗疗效负相关预测因子。17篇文献中1008例NSCLC患者中165例 （16%）有KRAS突变。KRAS突变与TKI治疗缺乏反应密切相关。

    EGFR抑制剂获益的患者需具备完整的KRAS基因，但这一点并不足够，其他因素也可能产生对EGFR抑制剂耐药性。NSCLC患者KRAS突变占20%,其中少于3%患者同时具有EGFR突变，其余97% 为野生型EGFR.KRAS/EGFR同时突变和EGFR野生型与EGFR靶向治疗无反应性相关。

    4.3 BRAF突变

    KRAS和BRAF基因位于EGFR信号通路下游，是该信号通路的基本组成成分。BRAF蛋白是依赖KRAS-GTP活化的丝/苏氨酸激酶。BRAF主要功能包括通过磷酸化活化MAPK、MEK1和MEK2信号途径。突变的BRAF蛋白激酶活性增加，使NIH3T3细胞发生转化。不论KRAS是否有突变，BRAF突变都可促进肿瘤细胞生长。

    BRAF与KRAS突变呈现相互排斥的现象。BRAF突变与腺癌的不同的组织学亚型具有相关性。Yousem 等分析了222例无KRAS和EGFR突变的肺腺癌患者。其中10例腺癌有BRAF-V600E突变。 BRAF突变常见于微**亚型。 De等检测了15例原发微**型肺腺癌，发现3例（20%）有BRAF突变。BRAF-V600E突变在女性肺癌患者稍多（6:4）。老年人发生小叶内卫星结节及N2期淋巴结转移较多[48].腺癌大部分是伴有**状亚型（80%）和细支气管肺泡亚型（50%）混合亚型腺癌。由于小样本量实验结果，目前仍不能肯定BRAF突变是否为肺癌***的分子亚型。

    结直肠癌患者中BRAF突变能降低Panitumumab或Cetuximab疗效。通过对132例患者的回顾性研究分析，治疗有效者均无BRAF突变，而79例无效患者中11位（14.0%）有BRAF V600E等位基因突变。

    然而与KRAS相比，BRAF突变在NSCLC患者中检出率较低。据报道8%的BRAF突变位于BRAF激酶域。Brose等在292例NSCLC肺癌患者中发现5例（1.7%）有BRAF突变。其中，3例突变位于第11号外显子，2例突变位于第15号外显子。BRAF是EGFR下游信号分子，其是否能作为EGFR抑制剂疗效的预测分子仍需大量临床试验验证。 V600E错义突变是BRAF蛋白质第600位密码子的缬氨酸被谷氨酸取代，90%恶性肿瘤中可以检测出这种突变。恶性肿瘤常出现丝氨酸-苏氨酸激酶BRAF点突变，它给部分 NSCLC患者靶向治疗带来新的契机。

    4.4 ALK 基因重排

    间变淋巴瘤激酶（ALK）基因编码受体酪氨酸激酶，ALK融合蛋白是由ALK胞内激酶域和其它基因的氨基酸端组合而成。部分NSCLC患者基因组有EML4-ALK融合基因。目前肺癌**发现7个融合基因。所有融合基因的ALK胞内端酪氨酸激酶域均起始于第20号外显子编码的基因序列。EML4-ALK由第2号染色体短臂插入（p21;p23）引起，编码活化的蛋白酪氨酸激酶。 有研究发现EML4-ALK基因融合是由EML4不同的外显子与ALK结合而成。 ALK也可与其它基因结合形成融合基因，如KIF5B和TFG.活化的ALK通过激活下游PI3K/Akt和MAPK信号途径参与抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。NSCLC人群中EML4-ALK融合基因阳性率很低，大约6%[50].EML4-ALK基因融合以及EML4-ALK融合蛋白可活化 RAS/RAF/MEK/MAPK信号途径。此外，其它两种少见的ALK融合基因也有报道。携带EML4-ALK 融合基因的NSCLC患者均为野生型EGFR和KRAS.他们多为年轻人，发现时常为晚期，无吸烟史，肿瘤常呈实体型，且常出现印戒细胞。

    一项关于携带EML4-ALK融合基因肺癌患者服用MET/ALK小分子抑制剂，PF-02341066的I/II期临床试验。19例携带EML4-ALK融合基因非小细胞肺癌患者，其中10例（53%）对PF-02341066客观疗效。其中15例（79%）在接受治疗8周后发现肿瘤受到抑制，部分患者维持到40周，仅有4例出现疾病进展。Kwak等 发现1,500例晚期NSCLC患者中82例携带ALK融合基因。其中大部分 （96%）为腺癌。94%患者既往接受过至少一项治疗。82位患者均接受口服crizotinib（ALK TKI小分子抑制剂）治疗，疾病控制率为90%,其中治疗反应率为57%,其余33%病情稳定。Rodig等探讨了关于西方人肺腺癌中ALK重排发生率以及重排特点，旨在优化临床检测ALK重排的模式。他们应用FISH和免疫组化检测358例肺腺癌标本，再次证明ALK重排与年轻患者，无吸烟史，临床呈进展期，组织学呈伴有印戒细胞的实体型腺癌相关。ALK重排不会同时伴有EGFR突变。这项研究证明西方人ALK重排少见，但却代表了一个***的临床亚型，并且有可能对这类患者选择不同治疗方法。对于可疑病例，FISH和免疫组化同时验证对诊断肺腺癌ALK重排更准确[52].Zhang等通过对266例中国NSCLC患者的研究，得出相似的结论。

    Shaw等在141例NSCLC患者中发现19例（13%）有EML4-ALK融合基因，31例 （22%）有EGFR突变，91例（65%）两者均为野生型[42].其它研究也表明EML4-ALK 和EGFR存在具有排斥性[42].但是，Tiseo等报道一例48岁无吸烟史的白种人诊断为EGFR突变和ALK转位同时存在的肺癌患者，并且对Erlotinib耐药，这可能代表一小部分NSCLC患者。EML4-ALK重排人群中无EGFR突变，而EGFR突变人群无ALK重排[42]. 转移肺癌患者，EML4-ALK重排与EGFR-TKI耐药相关。

    与EGFR突变人群和野生型EGFR/ALK人群相比，EML4-ALK融合基因肺癌人群更年轻，男性居多[42].但是，也有研究显示男女相当。EML4-ALK融合基因肺癌人群更多是无或少吸烟史。19例EML4-ALK阳性肺癌中18例为腺癌，大部分为印戒细胞亚型。EML4-ALK代表NSCLC一种特殊的分子亚型。特别指出的是EML4-ALK融合基因肺癌患者不能获益于EGFR-TKI靶向治疗，需应用ALK靶向药物。

    总之，以EGFR为靶点的治疗能有效治疗NSCLC患者。EGFR突变可作为筛选EGFR-TKI靶向治疗对象的指标，同时也可作为EGFR靶向疗效的预测因子。但是，越来越多证据显示NSCLC具有多种亚型，每种亚型都具有各自独特的分子改变。确定分子亚型、筛选靶向治疗人群的指标都是NSCLC个体化治疗的关键。EGFR及下游因子检测有助于筛选合理的治疗对象，KRAS/BRAF 突变与EGFR突变存在相互排斥，很少同时出现在NSCLC患者。这也可能在肺癌病因学及EGFR-TKI靶向治疗耐药中发挥重要作用。总之，EGFR或其下游关键分子靶向治疗将成为未来NSCLC治疗的规范化治疗手段。联合预测模式不能应用于所有肿瘤类型，仍需更好地筛选合理治疗对象，EGFR分子指标仍需进一步研究并结合临床参数，更好指导NSCLC患者的治疗策略，实现真正的个体化诊治。

    参考文献

    1.Cheng L, Alexander RE, MacLennan GT, et al. Molecular pathology of lung cancer: Key to personalized medicine. Mod Pathol 25:347-369, 2012.

    2.Cheng L, Eble JN （ed） Molecular Surgical Pathology, 1st edition, Springer, New York, NY, 2013.

    3.Cheng L, Zhang DY, Eble JN （ed） Molecular Genetic Pathology, 2nd edition, Springer, New York, NY, 2013.

    作者简介：

    程亮，现任美国印第安那大学医学院病理系及泌尿系终身教授，分子诊断实验室主任，泌尿病理主任。程亮毕业于北京医科大学（北京大学医学部），后在美国Case Western Reserve University和Mayo Clinic接受专业病理训练，持有美国外科病理、临床病理和分子遗传医师***。现任Molecular Cancer （Associate Editor）， Eur J Cancer, Future Oncology, Urol Oncol, Crit Rev Hematol Oncol, Am J Surg Patholy, Mod Pathol, Hum Pathol,J Pathol, Histopathology, J Clin Pathol等30多个杂志的编委，在影响因子较高的期刊，包括PNAS,JNCI,J Clin Oncol, Cell Metabolism, Nature Biotechnol, Cancer Res, Oncogene和Clin Cancer Res,发表学术论文700多篇， 被引用超过23000多次（h-index,80）。主编和撰写著作有Molecular Genetic Pathology, Urologic Surgical Pathology,Essentials of Anatomic Pathology,Atlas of Genitourinary Pathology,Molecular Surgical Pathology, Rare Urologic Tumors,Atlas of Anatomic Pathology,及Bladder Pathology.