中药抗肿瘤药物非临床筛选评价与开发研究

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中国医学科学院药物研究所  陈晓光
一、    前言
中药抗肿瘤药是指以活血化瘀、软坚散结、清热解毒、疏肝理气、扶正固本为主要功效的药物，主要用于恶性肿瘤的治疗及辅助治疗。
恶性肿瘤属中医“癌”、“岩”、“恶肿”、“积聚”等范畴，系正气虚弱、留滞客邪、气滞血瘀、邪毒积聚、蕴郁成块所致。外感六淫、饮食不节及七情失常、脏腑功能失调、正气亏损是形成肿瘤的主要因素；气机不利、瘀血阻滞、湿痰凝聚、毒邪内聚、正气亏虚是肿瘤发生的主要机制；气滞血瘀型、痰湿凝聚型、热毒内结型、气血虚弱型或多种证型的复合则是临床上常见的肿瘤证型。现代医学认为，它涉及物理、化学、生物、遗传、激素、营养、免疫等多种因素，其发生的根本原因是正常细胞核基因的异常改变。 v3jg——“!
中药，尤其是中药复方，与西药相比，其主要特点在于抑制或杀伤肿瘤细胞的祛邪作用，调整机体免疫功能的扶正作用，提高放疗、化疗的增效作用以及降低其他治疗方法（放疗、化疗）毒副反应的减毒作用。因此中药抗肿瘤药物的药效学评价根据药物的作用特点可从祛邪作用、扶正作用、增效作用和减毒作用等四个方面进行。具体药物的非临床研究应在此基础上，根据药物的自身特点制定研究方案。 & J2M1z%
下述的试验分组和剂量设计等主要适用于临床单药治疗。这里所赘述的不属于指导原则，如有与既往指导原则或现有”细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则“不符之处，请参照有关指导原则执行。
二、祛邪作用
（一）    抗肿瘤药物体外试验
体外试验主要用于对候选药物进行筛选，初步了解受试物的作用强度和敏感瘤种及作用机理，为随后进行的体内试验提供参考。
在体外培养的不同人肿瘤细胞系中加入不同浓度的待测药物，采用磺酰罗丹明染色法（SRB法）、四氮唑盐还原法（MTT法）、集落形成法等方法进行检测，计算药物的半数抑制浓度（IC50），并与标准治疗药物进行比较，可以初步预测中药抗肿瘤药物的抗瘤谱和作用强度。应根据药物的作用特点、作用机理以及有否颜色干扰确定体外试验采用的研究方法。
试验中，在选择肿瘤细胞系时应考虑到细胞的生长和增殖速率，一般至少应选用10-12种人肿瘤细胞系。药物与细胞共培养的时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再加药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照为标准抗肿瘤药，阴性对照为溶剂对照。试验至少应重复一次。
创新性中药抗肿瘤药物应进行作用机理研究，如药物作用靶点、细胞周期特异性、耐药情况等，作用机理研究对于后期非临床和临床试验的设计和评价具有重要的参考价值，应伴随药物的开发过程不断深入。对于创新性中药，主要的作用机制研究资料应在申请临床时提交。
（二）抗肿瘤药物体内试验
体内试验用于进一步考察受试物对特定类型肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率、周期等。
体内试验通常采用动物肿瘤移植模型和人体肿瘤异体移植模型。由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，仅可用于候选化合物的初步筛选，但如果受试物通过免疫机制发挥抗肿瘤作用，可考虑采用动物肿瘤移植模型。通常情况下，以人体肿瘤异体移植模型试验结果来评价受试物的抗肿瘤有效性。
1、模型建立
动物肿瘤移植模型试验通常在近交系或远交系的敏感品系，观察药物对肿瘤生长的抑制作用；人体肿瘤异体移植模型试验通常在无胸腺鼠或联合免疫缺陷小鼠体内移植人体肿瘤细胞系，观察药物对肿瘤生长的抑制作用。移植肿瘤的选择主要依赖于体外试验结果、细胞系的生物学特点等因素。由于体内试验中药物的抗瘤谱可能与临床有效性呈正相关，原则上，应尽量选用多种人体肿瘤异体移植瘤模型；移植的人体肿瘤细胞系应在组织学等方面应与人体肿瘤尽量接近。
中药抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用3——4种人体肿瘤异体移植瘤模型。模型的建立和使用应注意：移植瘤复苏后应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代。
2、试验设计
肿瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、肾囊下和原位等。动物移植性肿瘤一般在移植后次日将动物随机分组给药；人体肿瘤异体移植模型通常待移植肿瘤生长至少达100mm3后将动物随机分组给药。一般包括高、中、低3个剂量的治疗组、阳性对照组和阴性对照组。治疗组受试物剂量的选择应能够体现出药物的量效关系，高剂量不宜超过受试物的最大耐受量。应根据受试物的毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同。阳性对照药一般应满足以下条件：（1）与受试物作用机制相同或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药的给药方案应能够体现出药物的最佳治疗作用，其剂量一般不宜超过最大耐受量。阴性对照组给予相应的溶剂或辅料。
3、检测指标
对于实体型动物移植性肿瘤模型，推荐使用称瘤重的方法。对于人体肿瘤异体移植瘤模型，推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次。在试验中还应该观测与药物安全性有关的指标，如动物体重增长和死亡率，将治疗组的这些数据与标准（阳性）治疗对照组进行比较，对于判断药物的安全性和开发前景具有重要的意义。试验中应记录检测指标的变化与给药时间的关系，以便了解药物的作用特点，减少单次记录试验结果可能引起的误差。体内抗肿瘤试验结果中还应同时附有相应的照片。
免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，对于人体肿瘤异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。
4、评价标准
对于体内试验结果的评价应综合考虑受试物的作用机制、模型的临床相关性、每一种模型的具体试验结果以及受试物与阳性对照药物试验结果的比较。
对于每一种实体型动物移植性肿瘤模型，推荐采用瘤重的肿瘤抑制率（%）作为试验评价指标。评价标准通常为抑制率（%）≥50 %,并经统计学处理P < 0.05为有效。 &Rvm>TC=
针对每一种人体肿瘤异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C（%）作为试验评价指标。评价标准通常为：T/C（%）>50 %为无效；T/C（%） ≤50%,并经统计学处理P < 0.05为有效。在体内有效性试验采用的全部人体肿瘤异体移植瘤模型中，一般至少应有2种达到有效标准，才提示药物有必要进入临床试验。
在评价时还尤其应关注受试物与阳性对照药试验结果的比较。在毒性相当（在有效性研究中主要表现为动物死亡率和体重下降相当）的情况下，对受试物治疗组和阳性对照药组肿瘤增殖率的比较也是评价受试物是否有必要进入临床试验的重要指标之一。
三、扶正作用
（一）对荷瘤动物免疫功能的调节作用
具有扶正作用的药物应具有以下方面作用
1.影响荷瘤动物免疫功能  根据肿瘤生长过程中机体免疫功能受损的情况，选择其细胞免疫或体液免疫的2-3个指标，观察药物对荷瘤动物免疫功能的影响。
2.影响荷瘤动物生物调节因子  选择干扰素、白细胞介素或肿瘤坏死因子等与肿瘤生长有关的生物调节因子作为指标，在荷瘤动物观察药物对它们的影响。
3.影响荷瘤动物一般状况  在荷瘤动物中，观察药物对动物一般状态、体重、食欲、应激能力（如耐疲劳、耐缺氧等）的影响。
4.具有一定的抗肿瘤作用  选择3种及以上实体型动物移植性肿瘤模型，观察药物对瘤重的影响，经重复试验，取得可信的结果。
（二）影响荷瘤动物免疫功能及肿瘤抑制试验
以放、化疗荷瘤小鼠为模型，观察待试药物对荷瘤动物免疫功能的保护作用。肿瘤移植后次日动物随机分组，一般包括：阴性对照组（肿瘤对照组）、免疫功能低下组（给化疗或放疗）、阳性对照组（阳性药+化疗或放疗），高、中、低3个剂量给药组+化疗药或放疗（待试中药亦可在接种肿瘤前预先给予）。应根据受试药物的作用特点和毒性反应等确定给药频率和周期，给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同。移植肿瘤的选择主要依赖于预期的临床适应症和细胞系的生物学特点。模型的建立和使用应注意：移植瘤复苏后应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代。
试验过程中观察药物对动物一般状况、体重和食欲等影响，试验结束称体重和瘤重，同时测定各项免疫指标。造模成功指标和药物疗效观察：肿瘤模型应有明显免疫功能低下；药物应具有一定的抑瘤作用，通常肿瘤生长抑制率（%）≥40%,并经统计学处理P<0.05为有效。应在3种及以上的动物移植性肿瘤模型上经重复试验得到证实，且能改善荷瘤动物低下的免疫功能。
四、增效作用
（一）对放疗的增效作用
选用临床使用的放疗源如60Co或X光，与中药合用，观察受试药物使肿瘤对放疗的敏感性（即是否可增加射线对肿瘤的杀伤力）。试验至少应设空白对照、单纯放疗及放疗加中药高、中、低3个剂量组和阳性药对照组，观察有无协同增效作用。
（二）对化疗的增效作用
选用烷化剂、代谢拮抗剂或抗肿瘤抗菌素等有代表性的抗肿瘤药，与中药合用，观察有无协同增效作用。试验时，应设空白对照、化疗药及化疗药加中药高、中、低3个剂量组和阳性药对照组，进行对比观察。其联合应用的最终效应表现为以下5种形式：（1）相加效应：假设化疗药物的抗肿瘤效应为1,中药的作用亦为1,则1+1=2,化疗药和中药可作用于抑制肿瘤的不同环节，其最终抗肿瘤效应相加。（2）次相加效应：化疗药和中药合用，其联合效应小于相加，但大于各自单独使用时，即1<1+1<2.（3）协同效应：联合治疗的作用大于相加效应，即1+1>2.（4）增敏效应：中药本身细胞毒作用较小，但它和化疗药合用时能提高化疗药的杀伤肿瘤细胞的效应，即0+1>1,这种中药才是真正意义上的化疗增敏剂。（5）拮抗效应：中药和化疗药合用，使化疗药的杀伤肿瘤细胞效应降低，即0+1<1.
五、减毒作用
减毒的抗肿瘤辅助药，应对肿瘤生长无明显影响或有一定抗肿瘤作用；能对特定的化、放疗的毒副作用有肯定的防止作用；不影响化、放疗的疗效；对荷瘤动物机体的正常功能无明显损伤作用。其作用可以从以下几方面考察。
1. 对荷瘤动物化疗或放疗毒副反应的减毒作用  选择放疗或化疗药，分别加用中药，观察对放、化疗主要毒副反应的影响。荷瘤或正常动物用某些化疗药物治疗后，往往产生白细胞下降，食欲降低或肾功能降低等骨髓抑制、消化道的毒副反应和肾功能损伤等，加用受试药物后观察药物对特定毒副反应的影响。动物随机分组，至少包括阴性对照组、单独化疗或放疗出现毒副反应组、化疗或放疗出现毒副反应+阳性药对照组、化疗或放疗出现毒副反应+高、中、低3个剂量的受试药物组。应根据受试药物的作用特点和毒性反应等确定给药频率和周期，给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同。移植肿瘤的选择主要依赖于预期的临床适应症和细胞系的生物学特点。模型的建立和使用应注意：移植瘤复苏后应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代。
实验期间每日记录耗食量，处死动物前称体重；观察各组用化疗药或放疗后，毒副反映出现情况，即白细胞数量、耗食量及体重增减及肾功能指标等，然后判断受试药物的减毒作用强度。造模成功指标和药物疗效观察：给一定剂量化疗药或放疗后，动物必须出现特定的毒副反应（白细胞下降、厌食、肾功能指标BUN、肌酐等增高）。加用受试药物后对抗化疗药或放疗引起的白细胞下降、食欲降低或肾功能降低。
2. 对正常动物化疗或放疗毒副反应的减毒作用  试验方法基本同上。
3. 对荷瘤动物的抗肿瘤作用  选择3种及以上的动物移植性肿瘤或人体肿瘤裸鼠异体移植模型，观察药物对瘤重（抑制率%）和肿瘤体积相对肿瘤增殖率（T/C%）的影响。
附件
1.MTT法测定药物对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用  活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT（3-（4,5-dimethylthiazol-2-y1）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）还原为不溶性的蓝紫色甲臢 （Formazan），死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臢后可用酶标仪在参考波长450nm,检测波长570nm处检测光密度。光密度值与活细胞数成正比。
具体方法：将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为1×104个/ml的细胞悬液，按1000个细胞/孔接种于96孔板，每孔加100μl.次日加含不同浓度化合物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl（DMSO终浓度<0.1%），受试药物设5——7个剂量组，每组设三个平行孔，于37℃继续培养48-72h后，每孔加无血清培养基新鲜配制的0.5mg/ml MTT 100μl,继续培养4 h,然后，每孔加200μl DMSO溶解甲簪颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值（OD） （参考波长450nm,检测波长570nm），以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，按下述公式计算受试药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算半数杀伤或抑制浓度IC50:
抑制率（%）=
2.SRB法测定药物对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用  Sulforhodamine B（SRB）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD值与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
具体方法：将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为2×104个/ml的细胞悬液，按2000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl.培养24h后加入待测药物，同时测定此时细胞的OD570值（T0）。加药48-72h后进行测定，每孔加预冷的50% TCA液50μl固定细胞（TCA终浓度10%），静置5min,将96孔板移至4℃放置1h;倒掉固定液，去离子水洗5遍，每孔加SRB液100μl（用1%醋酸配成4mg/ml溶液），室温放置10min;1%醋酸洗5遍，吸干；加150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液（pH 10.5）溶解，稳定10min后测定OD570nm值。按中效方程计算细胞50%生长抑制所需的药物浓度（GI50），100%生长抑制所需的药物浓度（TGI），杀死50%细胞所需的药物浓度（LC50），.
公式： GI50:即[（T-T0）/（C-T0）]=50%时的药物浓度      TGI:即T=T0时的药物浓度       LC50:即[（T-T0）/（C-T0）]= -50%时的药物浓度注：C表示对照组细胞的OD值      T表示加药物组细胞的OD值
T0表示加药时对照平板细胞的OD值
3.集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生长抑制作用  肿瘤克隆原细胞具有在一定培养物上形成集落的能力。当培养物接种的细胞较稀疏时，每个集落彼此不接触，通过集落计数可对克隆原细胞做定量分析，它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗肿瘤药活性。
具体方法：取对数生长期细胞，配制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为50-100个/ml,按2ml/孔将单细胞悬液接种于6孔板内，培养24h后，加不同浓度的药物，空白对照组和加药物组均各设3个平行孔，根据不同细胞株倍增周期的差别，药物持续作用7——14d后，弃培养基，每孔用PBS洗2次，2ml/次；无水甲醇固定5min,静置干燥； 2ml 1%结晶紫染色5——10min后，用自来水冲洗掉多余的染料，室温干燥；计数每孔大于50个细胞的集落，根据下述公式计算各加药物组集落形成率，按照中效方程计算IC50值：
加药物组集落平均值
加药物组集落形成率（%）= ——× 100%
空白对照组集落平均值
ImY*cW=M
HNyDWD）_
4.动物移植性肿瘤模型  常用的动物移植性肿瘤瘤株有小鼠白血病L1210、小鼠淋巴细胞性白血病P388、小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌、小鼠结肠癌C26、小鼠肉瘤180、小鼠肝癌H22、大鼠Walker-256癌等。同种动物移植性肿瘤模型系选择3-4种的小鼠、大鼠移植性肿瘤作试验治疗。实体瘤观察瘤重抑制率（%），腹水瘤或白血病观察生命延长率。观察瘤重抑制率，要求对照组瘤重均值在小鼠不得低于1g;实验治疗组动物平均体重下降不得超过15%;动物死亡数不得超过20%;瘤重抑制率至少在50%以上，与对照组有显著性差异。观察生命延长率，同途径给药应在75%以上；异途径给药应在50%以上；对照组20%动物存活时间不得超过4周。瘤株选择应尽量考虑与临床拟治疗肿瘤的性质、部位等相近似，如拟治疗肝癌，可首选用肝癌瘤株等；给药途径应与临床一致，并设至少三个剂量组；对每一种瘤株的试验治疗应获得可重复性的结果。
5.人体肿瘤裸鼠异种移植模型  裸鼠又称无胸腺小鼠，具有四个特点：①先天性胸腺缺失；②胸腺依赖性免疫功能缺乏，其T细胞功能接近于零，但B细胞功能大致正常；③人体肿瘤异种移植时无排斥反应，故可供人体肿瘤移植。异体移植后的人体肿瘤在裸鼠仍保持其原有的组织形态及免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感型，移植后的人体肿瘤仍保持其原有的功能。④裸鼠因皮肤无毛、操作方便，易于动态观察肿瘤之生长状态。疗效的评价方法，采用相对肿瘤体积的肿瘤增殖速率（T/C%）。
具体方法：用灭菌生理盐水调整细胞密度至1-5×107个/ml,取0.2ml接种于裸鼠腋窝皮下，待肿瘤生长至直径为1cm大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋窝皮下。待肿瘤生长至体积至少100mm3时，分组给药。每周2-3次称量体重并用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，按照公式V=a×b2/2计算出肿瘤的体积，其中a为肿瘤的长度，b为肿瘤的宽度。实验完成时，将裸鼠脱臼处死并拍照，然后剥离肿瘤，称重并拍照。最后根据相对肿瘤体积（RTV）计算肿瘤增殖速率（T/C%），并绘制肿瘤生长曲线，依据肿瘤重量计算肿瘤抑制率（%）。
RTV = Vt/V0
给药组的RTV均值
T/C% = —— ?
对照组的RTV均值
注：Vt为每次测量时的肿瘤体积，V0为开始给药时的肿瘤体积。
对照组肿瘤重量 – 给药组肿瘤重量
肿瘤抑制率（%）=—— ? 100%
对照组肿瘤重量 ;
（摘自西部药学***）

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瘤药是指以活血化瘀、软坚散结、清热解毒、疏肝理气、扶正固本为主要功效的药物，主要用于恶性肿瘤的治疗及辅助治疗。
恶性肿瘤属中医“癌”、“岩”、“恶肿”、“积聚”等范畴，系正气虚弱、留滞客邪、气滞血瘀、邪毒积聚、蕴郁成块所致。外感六淫、饮食不节及七情失常、脏腑功能失调、正气亏损是形成肿瘤的主要因素；气机不利、瘀血阻滞、湿痰凝聚、毒邪内聚、正气亏虚是肿瘤发生的主要机制；气滞血瘀型、痰湿凝聚型、热毒内结型、气血虚弱型或多种证型的复合则是临床上常见的肿瘤证型。现代医学认为