6 娇嫩细菌 Mueller-Hinton培养基只适用于快速生长的细菌,一般不适于测定娇嫩细菌。娇嫩细菌的药敏试验如果要用纸片法做,培养基、质量控制方法、解释标准都须做修改以适合每种细菌。以下介绍的纸片方法用于 流感嗜血杆菌, 淋病奈瑟氏菌和 肺炎链球菌等娇嫩细菌,结果是准确的。其他细菌须用稀释法测定。厌氧菌不能用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性。 6.1 嗜血杆菌 6.1.1 培养基 纸片扩散法试验适用的培养基称为:嗜血杆菌试验培养基(HTM),配方如下:(1)Mueller-Hinton琼脂;(2)15μg/mlNAD;(3)15μg/ml牛血红素;(4)5μg/ml酵母粉;(5)pH7.2-7.4;配制HTM,先配制血红素贮存液:50mg血红素加到100ml 0.01M热NaOH液中,搅拌至粉末完全融解。此贮存液30ml加入到1000mlM-H琼脂中,再加入5g酵母粉。高压灭菌,冷却后,加入3mlNAD贮存液(50mgNAD溶于10ml蒸馏水,过滤除菌)。不能用巧克力M-H琼脂做嗜血杆菌的药敏试验。 6.1.2 操作步骤 用过夜培养的巧克力平板上的菌落制备接种菌液,操作如下:(1)直接用过夜培养的巧克力平板上的菌落在M-H肉汤或生理盐水中调制菌悬液,用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊,校正浓度。合格的菌液浓度为:1-4×108CFU/ml。制备菌液应特别注意,菌液浓度过高可导致出现对某些β-内酰胺类药物的假耐药结果,特别是某些产β-内酰胺酶的流感嗜血杆菌。菌液须在15分钟内使用。(2)其他步骤按5.2操作,不同处在于:直径150mm平板至多贴9张纸片。(3)平板放5-7%CO2环境,35℃过夜孵育16-18小时,测量抑菌环直径。 6.1.3 抑菌环解释标准 嗜血杆菌应测的药物浓度见表1A,按表2A列出的抑菌环解释标准判定结果。除此之外无需测定其他药物。 6.2 淋病奈瑟氏菌 6.2.1 培养基 测定淋病奈瑟氏菌的标准培养基是加有1%添加剂的GC琼脂,不必补充其他添加剂,也不能用强化的巧克力琼脂。 6.2.2 操作步骤 (1)直接用过夜培养的巧克力平板上的菌液在M-H肉汤或生理盐水中调至菌悬液,用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊,校正浓度。菌液须在15分钟内使用。(2)其他步骤按5.2操作,不同之处在于:直径150mm平板至多贴9张纸片,100mm平板至多贴4张。(3)平板放5-7%CO2环境35℃孵育20-24小时后,测量抑菌环直径。 6.2.3 抑菌环解释标准 淋病奈瑟氏菌应测的药物见表1A,按表2B列出的抑菌环解释标准判断结果。除此之外无需测其他药物。 注:在10U青霉素纸片周围产生的抑菌环≤19mm的菌株,一般均产生β-内酰胺酶。确认这种由质粒决定的耐药性菌株,应当做β-内酰胺酶试验。质粒决定的对四环素耐药的菌株,抑菌环直径≤19mm(30μg四环素纸片)。此外,由染色体决定的对青霉素和四环素耐药的菌株所产生的抑菌环较大,解释标准见表2B。 6.3 肺炎链球菌和其他链球菌 6.3.1 培养基 用加5%脱纤维羊血的M-H琼脂做肺炎链球菌和其他链球菌的药敏试验。 6.3.2 操作步骤 (1)直接用过夜培养的血平板上的菌落在M-H肉汤或生理盐水中调制菌悬液,用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊,校正浓度。菌液须在15分钟内使用。(2)其他步骤按5.2操作,不同处在于:直径150mm平板至多贴9张纸片,100mm平板至多贴4张。(3)平板放5%CO2环境35℃孵育20-24小时后,测量抑菌环直径。 6.3.3 抑菌环解释标准 肺炎链球菌和其他链球菌应测的药物见表1A,按表2C列出的抑菌环解释标准判定结果。 注:对青霉素敏感的菌株,苯唑西林抑菌环直径≥20mm。耐药和相对耐药的菌株抑菌环直径≤19mm,不能报告对青霉素耐药或中度耐药,须测MIC。苯唑西林药敏结果只能推测肺炎链球菌对青霉素的药敏,不能推测其他链球菌对青霉素的药敏。从无菌部位(如脑脊液、血液、骨髓等)分离的草绿色链球菌须测青霉素MIC。草绿色链球菌的青霉素药敏试验不能用纸片法。 6.4 甲氧苯青霉素耐药的葡萄球菌 仍有不少实验室在检测MRS时会遇到问题,为了更好检出这种菌株,需了解以下几点:(1)用苯唑西林纸片而不是甲氧西林或乙氧西林。因此,用1μg苯唑西林纸片检测甲氧西林/苯唑西林的耐药性。(2)直接用菌悬液法(5.1.2)接种。(3)检测MRS必须在35℃孵育满24小时(而不是16-18小时)。(4)借透射光仔细检查苯唑西林纸片周围抑菌环内有无细小菌落或轻微弥漫生长。(5)MRS通常对多种抗生素耐药,包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、氯霉素类和四环素类。了解是否多重耐药有助于推测对甲氧西林耐药性。(6)如果纸片法结果有疑问,需以筛选试验验证。(7)甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌对所有头孢菌素类和β-内酰胺类如阿莫西林/棒酸、阿莫西林/舒巴坦和依米配能耐药,无论体外试验结果如何。因为,至今的文献报道,β-内酰胺类药物治疗甲氧西林耐药的 感染效果很差,几乎没有治疗成功的资料。 6.5 耐药肠球菌 6.5.1 青霉素/氨苄西林药敏试验 肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药系因为产生低亲和力的青霉素结合蛋白(PBPs),个别菌株是由于产生β-内酰胺酶。纸片法药敏试验可准确测定PBPs改变的菌株,但对产β-内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应测β-内酰胺酶。 6.5.2 万古霉素药敏试验 肠球菌的纸片法万古霉素药敏试验,平板必须孵育24小时(而不是16-18小时),借投射光仔细检查抑菌环内有无小菌落或弥漫生长。纸片法结果为中介度时应测MIC. 6.5.3 氨基糖苷类高水平耐药试验 对氨基糖苷类药物高水平耐药,可提示不能用青霉素或粘肽类与氨基糖苷类联合用药治疗肠球菌的感染。用高浓度庆大霉素(120μg)和链霉素(300μg)纸片筛选这类耐药菌株。无抑菌环为耐药,抑菌环≥10mm为非高水平耐药。抑菌环在7-9mm之间再用稀释法筛选试验测定。特殊高浓度纸片的质控见表3。不必测其他氨基糖苷类药物,因为没有比庆大霉素或链霉素更强的同类药。 6.6 测定产超广谱β-内酰胺酶的革兰氏阳性杆菌 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是新认识的一类由质粒介导的β-内酰胺酶,如TEM-1、TEM-2、SHV-1。ESBLS导致肺炎克雷白氏菌、产酸克雷白氏菌、大肠埃希氏菌和另外几种肠杆菌出现对头孢三嗪、头孢他啶、氨曲南和广谱青霉素类及结构相关的β-内酰胺类药物的耐药。某些ESBLs导致高水平耐药,须用纸片法检测。另有低水平耐药株或只能用某个β-内酰胺类药才能测出来。这类菌株的MIC达不到NCCLS规定的耐药分界点,但临床治疗无效。克雷白氏菌和大肠埃希氏菌的临床分离株如果对博拿霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢胺噻肟或头孢三嗪的抑菌环减小,提示具有ESBL。细菌产生ESBL时,加入棒酸,抑菌环增大。ESBL测定的可靠方法尚在研究中。目前可参考表1和表4。 7 β-内酰胺酶试验 7.1 目的 对嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和卡他莫拉氏菌,快速β-内酰胺酶试验比纸片法药敏试验的结果快。对产β-内酰胺酶的肠球菌,这是唯一可靠方法。 β-内酰胺酶试验阳性可推测:(1)淋病奈瑟氏菌、嗜血杆菌、卡他布兰汉氏菌对青霉素、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素的耐药;(2)葡萄球菌对青霉素及氨基、羧基和酰尿基青霉素类药物的耐药性。 β-内酰胺酶试验阴性不排除尤其他耐药机制引起的耐药。不要测肠杆菌、假单胞菌和其他须氧革兰氏阴性菌的β-内酰胺酶,因为其结果不能预测临床治疗效果。 7.2 β-内酰胺酶试验方法的选择 以Nitrocefin为基质的方法测定淋病奈瑟氏菌、嗜血杆菌和卡他布兰汉氏菌、葡萄球菌及肠球菌,结果可靠。酸法青霉素酶试验用于测嗜血杆菌,淋病奈瑟氏菌和葡萄球菌结果可靠。碘法可用于淋病奈瑟氏菌,但卡他布兰氏菌只能用Nitrocefin方法。葡萄球菌β-内酰胺酶需要诱导,须在Nitrocefin培养基孵育1小时。简便的诱导方法是从苯唑西林纸片抑制环边缘挑菌落。只有操作必须仔细结果才能准确,试验时必须同时做阳性和或阴性对照。
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